[发明专利]一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型三重PCR检测方法、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种放线杆菌血清型的PCR检测方法，属于生物技术领域，具体涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型的三重PCR检测方法、试剂盒及其应用。 

背景技术

猪接触性传染性胸膜肺炎又称坏死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，以急性出血性纤维素性肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜炎为主要特征。急性者病死率高，慢性者常能耐过。 

猪接触性传染性胸膜肺炎各种年龄的猪均可感染，通常以2～5月龄、体重为30～60kg的猪多发。胸膜肺炎放线杆菌是对猪有高度宿主特异性的呼吸道寄生物，急性感染不仅可在肺部病理变化和血液中见到，而且在鼻液中也有大量细菌存在。猪群规模越大，发病危险亦越大。本病有明显的季节性，多在4～5月和9～11月发生。病猪和带菌猪是本病的主要传染源，无临诊症状有病理变化猪，或无临诊症状无病理变化阴性带菌猪较常见。如继发或并发其他疾病，常引起临诊症状加剧和死亡率升高。该病近年来在我国发生呈逐年上升的趋势，已成为危害养猪业最严重的疾病之一，给我国养猪业造成严重的经济损失。 

近年来，由放线杆菌所引起的猪接触性传染性胸膜肺炎已成为影响养猪业发展的一种重要细菌性疾病。发病后及时釆用抗生素进行治疗可显著降低动物死亡率，同时在生产过程中适当添加抗生素也可在一定程度上降低该病的发生率。但随着大量抗菌药特别是广谱抗菌药在养猪业中的广泛使用，细菌对抗菌药物的耐药性问题日趋突出，与此同时也有研究资料表明亚抑制浓度的抗生素可以影响细菌的代谢过程而改变细菌的毒力或细菌对环境的适应能力等。 

目前已报道的猪接触性传染性胸膜肺炎有15个血清型，各血清型具有特异性，其血清型特异性取决于加膜多糖和菌体脂多糖。根据烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的依赖性可把15个血清型分为两个生物型。生物Ⅰ型为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖菌株，包括血清型1～12型和15型；生物Ⅱ型的生长不依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长，包括血清型13、14。其中血清型1和5型又可分为A和B两个亚型，即血清型1A、1B和5A、5B。此外，还有一些分离到的放线杆菌依据现在的分类系统还不能划分其血清型。 

不同血清型间致病力有明显的差异，血清型间不存在交叉保护力。放线杆菌分布广泛，世界各国均有流行。随着各国之间引进种猪的不断增多，血清型也趋于复杂。一些国家或地区存在多个血清型同时流行，甚至同一猪场内还可能存在不同血清型。我国目前已发现并分离到血清型有1、2、3、4、5、7、8和15等多种血清型，主要流行血清型有1、3、5和7 型。 

目前，常用细菌血清型鉴定方法主要有血凝实验、ELISA法、PCR法等，其中血凝法和PCR法最为常用。但是从细菌分离培养到纯化及DNA提取至少需要3-4天才能做出初步鉴定，不仅费时费力，结果也不准确，而且敏感性差，容易产生假阳性的结果，不利于养殖户和规模化企业采取相应的血清型疫苗和药物来进行及时的治疗。 

发明内容

本发明的目的在于：提供一种适于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型三重PCR检测方法，本方法操作简便、省工省时，可以一次检测三种目的基因，为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌临床菌株的血清定型及检测提供技术支持和理论基础。 

在上述检测方法的基础上，相应提供了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型三重PCR检测的试剂盒，以及所述检测方法在猪接触性传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型三种血清型细菌中的单个或多个混合感染的样品检测中的应用。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型的三重PCR检测方法，包括以下步骤： 

(1)猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型临床菌株的DNA提取； 

(2)PCR产物扩增：扩增体系的建立，在PCR试剂管中加入反应液，反应液包括10×PCR buffer的PCR缓冲液、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及2型、3型和6型三对特异性异物，以步骤(1)提取的DNA为模板，反应液总体积为50μl，扩增体系的具体组成如下：