[发明专利]一种适于流式细胞分析的茄子叶片细胞核提取方法

说明书

技术领域

本发明提供了一种适于流式细胞仪分析的茄子叶片细胞核提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

流式细胞仪是以激光技术、光电测量技术、计算机技术、流动力学技术、电子物理、细胞免疫荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。各种微小生物颗粒如细胞、细胞核或染色体在鞘液中快速直线流动，逐个地通过一束入射光束，并用高灵敏度检测器记录下散射光及各种荧光信号，对鞘液中的细胞核或其他微粒进行多参数、快速的定量分析和分选。流式细胞仪在高等植物中的研究起步较晚，应用最为广泛的是利用流式细胞仪测定植物细胞DNA含量、倍性分析和细胞周期分析。然而由于植物具有细胞壁，为了制备个体完整，不聚集且大量的细胞核用于流式细胞仪分析的单细胞悬浮液比较困难，从而阻碍了流式细胞仪在植物研究中的应用。

利用流式细胞仪可以快速准确地鉴定各种植物的倍性，但是分析鉴定的结果受检测样品细胞核提取的浓度和纯度影响。如果样品细胞核悬浮液的浓度太低，则在分析图中出现的峰值会很低，令结果无法判断；如果样品核悬浮液中的杂质较多，则峰图较宽，杂质峰高，同样无法准确判断结果，因此，获得高浓度和纯度的样品细胞核悬浮液是利用流式细胞仪鉴定植物倍性的关键。

茄子(Solanum melongena L.)起源于亚洲东南亚热带地区，古印度为最早驯化地。我国栽培茄子的历史悠久，一般认为中国是茄子第二起源地。茄子是我国栽培较广的茄果类蔬菜之一，它不仅具有较高的营养价值，且食用方法也多种多样，是一种可以鲜干结合、周年供应、经济实惠的大宗蔬菜，深受广大生产者和消费者的欢迎。尤其是近年来随着设施农业的发展，茄子设施栽培得到了长足的发展，并成为高效农业的重要组成部分，在保证市场供应和促进农民增收中发挥着重要作用。

随着植物生物技术的发展，植物花药培养和花粉培养技术为茄子新品种的选育开辟了一条新途径。利用茄子花药和花粉培养可创造茄子不同倍性的材料，创新种质资源，对茄子品种改良具有重要的意义。因此，如何快速鉴定材料的倍性是茄子倍性研究中的重要内容之一。染色体计数法虽然准确性高，但操作复杂，用于大量材料的倍性鉴定仍相当困难。而使用流式细胞仪测定植物细胞核DNA含量以鉴定其倍性是一条快速、简便且准确性较高的途径。因此，寻找适合流式细胞仪分析的茄子细胞核微粒的制备方法，对使用流式细胞仪研究茄子倍性具有重要的意义。

目前，蔬菜作物上多采用Tris缓冲液提取细胞核，其组分为：15mmol/L Tris-HCl，80mmol/L KCl,20mmol/L NaCl,20mmol/L EDTA-Na2,15mmol/L巯基乙醇和0.1％(v/v)TritonX-100，pH7.5。也有部分植物采用Otto缓冲液和MgSO₄缓冲液，但由于不同植物材料因其结构和组分的不同，适合一种植物的细胞核制备方法并不一定适合于所有植物。发明人也利用前人这三种缓冲液和提取方法来制备茄子叶片的细胞核悬液，但并未取得很好的检测效果，存在提取产率不足和纯度低的问题，无法满足流式细胞仪的检测分析。由此针对这些问题并借助前人的经验，发明人进行了细胞核提取液配方的优化和提取方法的改进，旨在增加样品检测的准确性和成功率，降低核悬液中杂质的浓度，减少杂质对流式细胞仪分析的影响。

发明内容

技术问题 本发明的目的是提供一种适于流式细胞分析的茄子叶片的细胞核提取方法，该方法可增加样品检测的准确性和成功率，降低细胞核悬浮液中杂质的浓度，减少杂质对流式细胞分析的影响。该方法可用于流式细胞仪鉴定茄子不同倍性材料，也为其他作物的流式细胞仪鉴定倍性研究提供参考。

技术方案

为了实现本发明目的，本发明提供一种适于流式细胞分析的茄子叶片的细胞核提取方法，其所用的细胞核提取缓冲液组分为：

CPW盐溶液(KH₂PO₄27.2mg/L,KNO₃101.0mg/L,CaCl₂.2H2O 1480.0mg/L,MgSO₄.7H₂O 246.0mg/L,KI 0.16mg/L,CuSO₄.5H₂O 0.025mg/L,pH5.8)，0.5M甘露醇(mannitol)，3mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，0.25％(w:v)聚乙二醇(PEG)，0.5％(v:v)Triton X-100，0.25％(v:v)巯基乙醇，pH6.5-7.0。