[发明专利]一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，属于食品生物工程技术领域。

背景技术

乳果糖(4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-果糖)为乳糖异构物，是一种人工合成的二糖，又叫乳酮糖或异构化乳糖，是一种双歧杆菌促进因子。目前在世界范围内，乳果糖被广泛应用于医药、保健、食品添加剂以及动物饲料等行业。在临床医药行业，乳果糖主要用于治疗肝性脑病、便秘、内毒素以及降血糖、降胆固醇等，在食品行业中被广泛添加到婴幼儿奶粉、软饮料以及保健品中，主要是发挥其双歧杆菌增殖因子的作用。

目前，商业化的乳果糖一般由化学法提供。化学法生产乳果糖具有转化率高、可实现大规模生产等优点，但是化学异构法的缺点也很突出，如反应副产物多、脱盐操作复杂、高能耗等。为了克服化学异构法存在的各种弊端，酶法生产乳果糖以其反应条件温和、副产物少、操作简单、安全性高等优点使得生物酶法转化乳糖制备乳果糖的研究成为目前的研究热点。

传统的酶法生产乳果糖采用β-糖苷酶、β-半乳糖苷酶，存在转化率低、乳果糖浓度不高等问题。已有研究发现来源于Caldicellulosiruptor saccharolyticus的纤维二糖差向异构酶能够高效催化单一底物乳糖生产乳果糖。因此利用Caldicellulosiruptor saccharolyticus纤维二糖差向异构酶进行乳果糖酶法生产必将成为新的研究热点。

但是在大规模的工业化生产中，游离酶无法回收重复使用，不仅会增加生产成本，而且引入了外源蛋白，给后续的分离纯化造成困难，同时游离酶一般热稳定性、pH稳定性较差，不适合工业化连续化生产。而酶经过固定化处理后，固定化酶的热稳定性和pH稳定性都会得到增强，同时固定化酶可以反复回收利用，在实现连续化生产的同时还能简化下游分离纯化操作步骤，固定化酶应用于工业化生产有着其天然的优越性。

如何简单且高效地实现纤维二糖差向异构酶的固定化并应用于乳果糖的连续化酶法生产必将成为食品行业从业者面临的新任务。

发明内容

本发明提供的纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，是将产纤维二糖差向异构酶的全细胞经透化处理后，以壳聚糖和三聚磷酸钠(TPP)作为载体，加入交联剂，采用先絮凝包埋然后交联的方法，得到固定化的产纤维二糖差向异构酶细胞。

本发明提供一种纤维二糖差向异构酶全细胞的固定化方法，是将产纤维二糖差向异构酶的全细胞经透化处理后，加入助滤剂、壳聚糖和三聚磷酸钠(TPP)，待菌体絮凝后，弃去上清液，即得固定化细胞。

所述固定化方法具体是在经透化处理的菌体细胞干重为0.01-5g每100mL的细胞菌悬液中加入助滤剂混合均匀后，再加入壳聚糖溶液使每100mL溶液中含有壳聚糖为0.01-1g，再加入TPP溶液使每100mL溶液中含有TPP为0.01-1g，待菌体絮凝后，弃去上清液，即得到固定化细胞。

所述固定化方法的具体步骤为：

(1)调节经透化处理过的菌体细胞浓度至每100mL溶液中含有干重为0.1-5.0g的细胞，调节pH至3.0-8.0，形成菌悬液；

(2)向步骤(1)的菌悬液中每100mL加入0.1-1.0g的助滤剂，混合均匀，形成混合溶液；

(3)将壳聚糖溶液加入到步骤(2)所得的混合溶液中，使得到的体系中每100mL溶液中含有壳聚糖的质量为0.01-1g；

(4)缓慢加入TPP溶液到步骤3得到的溶液中，使最终体系中每100mL溶液中含有TPP质量为0.01-1g，混合均匀，待菌体絮凝后，弃去上清液，即得到固定化细胞。

所述透化处理可以被热处理代替，热处理条件是50-80℃下热处理5-120min。

所述透化处理，是指将产纤维二糖差向异构酶的细胞悬浮于透化试剂溶液中，4-30℃下混匀5-120min处理，即得到透化细胞。

所述透化处理中，细胞悬浮于透化试剂溶液后的终浓度为每100mL溶液中含有干重为0.01-5g的细胞。

所述透化试剂溶液是以下任意一种或者多种的混合：1-90％(v/v)的乙醇、0.1-5％(v/v)的甲苯、0.01-5％(w/v)的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.1-5％(v/v)异戊醇。

所述透化处理或热处理的细胞可以经真空冷冻干燥或者在20-50℃条件下烘干后制成菌粉再进行后续处理。

所述菌粉制备菌体细胞的菌悬液时，是用缓冲液溶解菌粉并调节缓冲液pH至3.0-8.0。