[发明专利]NDM‑1 锁核酸探针修饰电极及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于电化学检测领域，具体涉及NDM-1锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)探针修饰电极，还涉及该电极的制备方法和应用。

背景技术

目前研究报道的传感器表面固定的大多是DNA探针，存在诸多缺点。探针长度一般为20个碱基左右，DNA探针与较长的靶序列杂交时，结合力不高，碱基错配识别能力低。另外，由于单链DNA无法与未解旋的双链靶序列直接结合，所以待检测的标本需经PCR扩增后才能与之反应。同时，NDM-1探针的反应受离子强度的影响，酸性或碱性环境中DNA固定数量最多，而中性条件下杂交效果最好，固定双链探针比固定单链探针时杂交效果好，分析原因可能是单链固定时会对杂交产生更大的空间障碍。众多的研究者均未能很好地解决上述问题，从而无法提高DNA探针的特异性。而LNA的出现是解决以上问题的理想途径。

锁核酸是一种新型、特殊的双环状寡核苷酸衍生物，含有一个或多个2'-0,4'-C-亚甲基-B-D-呋喃核糖核酸单体，结构中核糖的2'-0,4'-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，连接成环形，呋喃糖的结构锁定在C3内型的N构型，形成了刚性的缩合结构，降低了核糖体构象的可塑性，增强了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，从而形成刚性缩合结构。相比其他寡核苷酸，LNA具有诸多优势：(1)和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性；(2)抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性；(3)LNA-DNA杂交物能激活RNaseH；(4)与RNA/DNA杂交时，具有较强的碱基错配识别力；(6)水溶性好；(7)高效的自动寡聚化作用，合成方法简单。

NDM-1多重耐药菌是指携带NDM-1耐药基因的细菌。NDM-1耐药酶其全称是“新德里金属-β-内酰胺酶”，是一种高效耐药酶。研究显示，抗生素滥用是NDM-1出现的首要原因，目前DM-1多重耐药菌正在全球快速传播，其感染病例在全球均有分布，死亡率高。多重耐药菌所带来的风险越来越大，防控形势极为严峻，该类细菌对几乎所有抗生素都具有抗药性。NDM-1耐药基因可以在细菌之间传播，从而使对抗生素敏感的细菌获得耐药性。因此，研发NDM-1直接快速特异的检测方法，具有重要意义。

目前，NDM-1多重耐药菌的诊断主要包括筛查、表型确认和基因确证等3个步骤。表型筛查是在细菌药物敏感性测定中，以美洛培南或亚胺培南纸片法(K-B法)或最低抑菌浓度(MIC)测定法对肠杆菌科细菌产酶情况进行初步筛查；表型确认是采用双纸片协同实验或亚胺培南(美洛培南)/EDTA复合纸片，进行K-B法药敏试验来判定产金属酶；基因确证是采用NDM-1的基因特异引物进行PCR扩增及产物测序，确定菌株是否携带NDM-1基因。但这些诊断方法存在着费时烦琐、敏感性和特异性较低及检测成本高等缺陷。

电化学DNA生物传感器具有分析时间短、设备微型化、特异性强、灵敏度高、检测限低、使用简单以及成本低廉等显著优点。目前电化学生物传感器的研究主要是致力于提高传感器的特异性和灵敏度，而特异性和灵敏度在很大程度上受探针与互补链间的相互作用影响，因此，利用LNA探针提高电化学生物传感器的特异性是检测NDM-1的基因的关键。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供NDM-1锁核酸探针修饰电极；本发明的目的之二在于提供所述NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法；本发明的目的之三在于提供含有检测NDM-1的电化学生物传感器；本发明的目的之四在于提供所述NDM-1锁核酸探针修饰电极或所述电化学传感器的应用；本发明的目的之五在于提供利用所述检测NDM-1的电化学生物传感器检测NDM-1基因的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、NDM-1锁核酸探针修饰电极，所述电极是在金电极表面固定5’端修饰巯基的NDM-1LNA探针，最后封闭非特异性吸附位点而得。

优选的，所述5’端修饰巯基的NDM-1锁核酸探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、所述NDM-1锁核酸探针修饰电极的制备方法，包括如下步骤：

a.将金电极打磨，抛光，清洁，干燥，得清洁的金电极，备用；

b.向步骤a所得清洁的金电极表面滴加含5’端修饰巯基的NDM-1 LNA探针的溶液，修饰后用巯基己醇溶液封闭，超纯水清洗得NDM-1锁核酸探针修饰电极。