[发明专利]一种脂肪酶、工程菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，涉及一种脂肪酶、工程菌及其制备方法。

背景技术

脂肪酶(Triacylglycerol acylhydrolase,Lipase EC3.1.1.30),又称甘油三酯水解酶，可催化酯化反应、醇解反应、氨解反应等。在有机溶剂中稳定性好，具有高度的位置选择性和异构体选择性。Candida rugosa原名Candida cylindracea，皱褶假丝酵母脂肪酶(C.rugosa lipases，CRLs)在化工、能源、食品、医疗等领域有广泛的应用，是目前工业应用最为广泛的商品化脂肪酶之一。在原始的C.rugosa菌株中，几种同工酶的表达量从高到低，依次是LIP1、LIP3、LIP2、LIP5和LIP4。

现已经报道是CRL1脂肪酶的不高，Brocca[Design,total synthesis,and functional overexpression of the Candida rugosa lip1gene coding for a major industrial lipase[J].Protein Sci.1998,7(6):1415-1422.]等首次用全基因合成方法将密码子CTG突变为TCN，合成了的lip1基因，并在Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris中异源表达，都得到有活性的蛋白，且转入P.pastoris的转化子在1-L摇瓶中pH 6.0条件下，发酵280小时酶活达到150U/mL，且对C8和C10长度的脂类显示较高的水解活力。2005年Chang[Multiple mutagenesis of the Candida rugosa LIP1gene and optimum production of recombinant LIP1expressed in Pichia pastoris[J].Appl Microbiol Biotechnol.2005,67(2):215-224.]等应用RT-PCR技术从C.rugosa(X64703)菌株中克隆lip1基因，利用Overlap extension PCR技术将该基因中的19个编码丝氨酸的CTG密码子突变为TCT，以P.pastoris KM71为宿主菌株，表达产物经纯化后，以三丁酸甘油酯为底物，酶活力为253.3U/mL。此外，Xunzhang Wang[Scale-up fermentation of recombinant Candida rugosa lipase expressed in Pichia pastoris using the GAP promoter]将lip1构建到含有GAP启动子的载体，并在毕赤酵母中过异源表达，在5L发酵罐中60h时酶活力仅有653.94U/mL，反应扩大至30L时，在72h的最高酶活力达到7,663U/mL，在800L的巨大的发酵罐中，最高酶活力仅有14,000U/mL。

可以看出，当前构建的工程菌在产量方面仍然不够，活性方面仍不够理想，经济效益不高。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种脂肪酶、工程菌及其制备方法，其目的在于通过改变脂肪酶密码子和工程菌的基因结构，由此解决目前工程菌生产脂肪酶，酶活不高经济效益不理想的技术问题。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种脂肪酶，所述脂肪酶，其基因序列为：

(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

按照本发明的另一方面，提供了一种工程菌，其宿主菌为毕赤酵母，在His位点处插入有如权利要求1所述的脂肪酶的基因序列。

优选地，所述工程菌，其脂肪酶的基因序列拷贝数大于或等于2。

优选地，所述工程菌，在其AOX1位点插入有分子伴侣组合基因，用于提高所述脂肪酶的表达量。

优选地，所述工程菌，其分子伴侣组合基因为pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列为：

(1)由SEQ ID No.2所示的基因序列；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或