[发明专利]一种脂肪酶、工程菌及其制备方法

权利要求书

1.一种脂肪酶，其特征在于，所述脂肪酶，其基因序列为：

(1)由SEQ ID No.1所示的基因序列；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

2.一种工程菌，其特征在于，其宿主菌为毕赤酵母，在His位点处插入有如权利要求1所述的脂肪酶的基因序列。

3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌在AOX1位点插入有分子伴侣组合基因，所述分子伴侣组合基因优选为pGAPZAEro1p-pPICZABip，其序列为：

(1)由SEQ ID No.2所示的基因序列；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的基因序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的基因序列；或

(3)SEQ ID No.2所示的基因序列经增加、确实或替换一个或多个密码子具有同等活性的由(1)衍生的基因。

4.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述脂肪酶基因上游，具有酿酒酵母的α-factor信号肽基因序列。

5.如权利要求2至4任意一项所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建脂肪酶基因表达载体：以用于His位点插入的毕赤酵母表达体系质粒为载体，依次包含AOX1强启动子、酿酒酵母的α-factor信号肽、以及如权利要求1所述的脂肪酶基因片段；

(2)构建分子伴侣组合基因表达载体：以用于在AOX1位点插入功能基因的毕赤酵母表达体系质粒为载体，插入的两段功能性基因，其中第一功能性基因依次包含AOX1强启动子和分子伴侣Bip基因片段，第二功能性基因依次包含GAP强启动子和分子伴侣ERO1p基因片段；

(3)制备脂肪酶表达转基因工程菌：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤(1)中构建的脂肪酶基因表达载体转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组工程菌；

(4)制备脂肪酶高表达工程菌，以步骤(3)中获得的重组工程菌为宿主菌，将步骤(2)中构建的分子伴侣组合基因表达载体转入，经过抗性筛选获得阳性克隆子，再经发酵定量筛选获得如权利要求2至4任意一项所述的工程菌。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述用于在AOX1位点插入功能性基因的毕赤酵母表达体系质粒为pPICZA/pGAPZA质粒。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)发酵定量筛选的发酵时间为120小时,接种量在1％至6％，优选接种量为4％。

8.如权利要求1所述的脂肪酶，其制备方法，包括以下步骤：

A、将如权利要求2至4任意一项所述的工程菌在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基中，26℃至30℃，培养16小时至20小时，得到种子液；

B、将步骤A中获得的种子液转接到发酵罐中，接种量在3％至10％之间，培养8小时至10小时，补加碳源，培养至发酵罐内培养液OD600在150至160之间，流加甲醇和山梨醇混合补料，维持溶氧值在15％至50％之间，获得发酵液；

C、将步骤B中的发酵液离心，收集上清液，即制得所述脂肪酶。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述碳源为甘油的水溶液，其质量浓度在40％至60％之间。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤B所述甲醇和山梨醇混合补料，其中甲醇和山梨醇的体积比在3:1至1:3之间。