[发明专利]一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法。 

(二)背景技术

γδT细胞是一类在多种免疫应答及免疫病理反应中具有重要作用的固有淋巴细胞。γδT细胞有别于大多数αβT细胞，其TCR受体由γ及δ两条链组成。生理情况下，γδT细胞在外周血中的数量占T淋巴细胞的0.5％-16％。γδT细胞具有多种细胞亚群，在正常人外周血中主要以Vγ9Vδ2γδT细胞亚群为主(大于70％)，Vδ1γδT细胞亚群仅占总γδT细胞的1％-10％。γδT细胞具有以下特点：1、非MHC限制性；2、分泌多种细胞因子；3、可被炎症，损伤，感染和肿瘤激活；4、肿瘤免疫监视作用等。自从Martin Wilhelm等2003年第一次将γδT细胞用于治疗非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤的临床试验取得一定效果以来，γδT细胞的体外激活扩增的技术方法成为新的研究热点，其对肿瘤的过继免疫治疗展现广阔的应用前景。 

目前基于肿瘤的γδT细胞过继免疫治疗的研究主要集中在Vγ9Vδ2γδT细胞亚群。与Vγ9Vδ2γδT细胞不同，Vδ1γδT细胞主要分布在肠上皮、皮肤、脾、肝等组织，在外周血中比例很低。研究报道Vδ1γδT细胞也有抗肿瘤作用，尤其是上皮来源的肿瘤。因此，Vδ1γδT细胞有可能成为肿瘤的细胞过继免疫治疗的候选细胞亚群。但是由于其细胞数量少，体外激活扩增获得大量Vδ1γδT细胞尤为必要。 

传统的γδT细胞体外激活扩增方法主要以扩增Vγ9Vδ2γδT细胞亚群为主，但在体外激活扩增后其细胞活性下降，凋亡细胞数量较多对肿瘤过继免疫治疗尤其是对实体瘤的治疗效果不佳。目前已有研究报道扩增方法 PHA+IL-2可以选择性扩增Vδ1γδT细胞，并能有效提高其对血液系统肿瘤的杀伤能力(Blood.2011Jul 28；118(4):992-1001.)。但仍存在以下问题：1)细胞扩增效率低，Vδ1γδT细胞亚群比例扩增至40％-60％，绝对细胞数量增加40-80倍左右，细胞纯度及数量均不能达到临床要求；2)细胞活性下降且凋亡细胞数量较多，扩增两周后10％-20％的Vδ1γδT细胞亚群凋亡；3)扩增后Vδ1γδT细胞对实体瘤细胞及肿瘤干细胞的杀伤能力没有评价。 

因此，如果能对从外周血获取的γδT细胞采用一种扩增效率高，杀伤肿瘤的细胞毒活性强，纯度高，且简单快捷，成本低廉的方法，则对今后大量扩增Vδ1γδT细胞亚群并将其应用于临床肿瘤过继免疫治疗具有重要的实际应用价值。 

(三)发明内容

本发明目的是提供一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法，该方法扩增效率高，杀伤肿瘤的细胞毒活性强，纯度高，且简单快捷，成本低廉，解决现有技术中细胞扩增效率低，扩增后细胞活性下降，凋亡细胞数量多，杀伤能力不足的问题。 

本发明采用的技术方案是： 

本发明提供一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法，所述的方法为：取外周全血，采用密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法收集总γδT细胞；将总γδT细胞用含改良1640培养基作为培养液重悬，在5％CO₂、37℃条件下进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，获得体外激活扩增的以Vδ1γδT亚群为主的γδT细胞；所述改良1640培养基组成为：体积浓度10％胎牛血清，50mg/mL青链霉素(青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml)，0.1-10μg/ml PHA(植物凝集素)和1-100ng/ml IL-7(白细胞介素7)，溶剂为1640培养基。 

进一步，所述密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法具体为： 

(1)取外周全血，用PBS以体积比1:1稀释，获得外周全血稀释液； 

(2)将比重为1.107的Ficoll淋巴细胞分离液加入离心管中，然后将步骤(1)的外周血稀释液缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液上层，水平离心机400g/min，20℃，离心25min，反应液依次分层为上层血清、白膜层细胞、Ficoll分离液层、粒细胞层和底层红细胞层；所述外周血稀释液与Ficoll淋巴细胞分离液体积比3:1； 

(3)将步骤(2)分离的白膜层细胞吸出并转移至新的离心管，用5倍体积的PBS洗2次，1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞a；