[发明专利]一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法

权利要求书

1.一种来源于外周血Vδ1γδT细胞的体外激活扩增方法，其特征在于所述的方法为：取外周全血，采用密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法收集总γδT细胞；将总γδT细胞用改良1640培养基作为培养液进行重悬，在5％CO₂、37℃条件下进行细胞培养，每2-3天换新鲜培养液，获得体外激活扩增的以Vδ1γδT亚群为主的γδT细胞；所述改良1640培养基组成为：体积浓度10％胎牛血清，50mg/mL青链霉素，0.1-10μg/ml PHA和1-100ng/ml IL-7，溶剂为1640培养基。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述密度梯度离心及免疫磁珠分选的方法具体为：

(1)取外周全血，用PBS以体积比1:1稀释，获得外周全血稀释液；

(2)将比重为1.107的Ficoll淋巴细胞分离液加入离心管中，然后将步骤(1)的外周血稀释液缓慢加至Ficoll淋巴细胞分离液上层，水平离心机400g/min，20℃，离心25min，反应液依次分层为上层血清、白膜层细胞、Ficoll分离液层、粒细胞层和底层红细胞层；所述外周血稀释液与Ficoll淋巴细胞分离液体积比3:1；

(3)将步骤(2)分离的白膜层细胞吸出，转移至新的离心管，用5倍体积的PBS洗2次，1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞a；

(4)以1×10⁷个细胞/40μl磁珠分选缓冲液a的量用磁珠分选液a重悬步骤(3)获得的细胞a，然后加入γδTCR抗体，4℃孵育10min，再加入磁珠分选缓冲液b和γδTCR磁珠抗体，4℃孵育15min，离心，沉淀用PBS洗1次，离心，弃上清，收集细胞b；所述磁珠分选缓冲液b与磁珠分选缓冲液a体积比为3:4；所述γδTCR抗体与磁珠分选缓冲液a体积比为1:4；所述γδTCR磁珠抗体与磁珠分选缓冲液a体积比为1:2；

(5)向步骤(4)获得的细胞b中加入PBS重悬，过MACS磁珠分选柱，PBS清洗柱子3次，1000r/min，离心5min，弃上清，收集细胞c，即获得γδT细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述1640培养基中PHA终浓度为1μg/ml。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述1640培养基中IL-7的终浓度为20ng/ml。