[发明专利]一种提取基因组DNA的提取液、其应用及利用该提取液快速高效提取烟草基因组DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学研究的基础技术技术领域，特别涉及一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法。

背景技术

烟草作为分子生物学研究的常用模式植物，在基因工程各项研究中的作用越发重要。由于烟草叶片富含多糖、蛋白和酚类物质，且含有大量的生物碱(如：烟碱)及其它多种次生物质，这就给为DNA的提取带来了极大困难，如酚类物质可以氧化成醌类物质可引起DNA降解、变色；蛋白与DNA结合造成DNA纯度下降，并影响后续分析；残存的多糖能抑制连接酶、限制性酶及PCR聚合酶的生物酶活，运用目前常用的方法不是费用高昂，操作繁琐，就是获得DNA纯度不高，得率低，且多糖、蛋白质的除去不彻底，影响后续试验的进行。

目前所常植物DNA提取方法主要有CTAB法、高盐低pH法、SDS裂解法及果胶酶解法等，在市场上也出现了各种提取DNA的试剂盒。本实验室常用试剂盒提取烟草基因组DNA，现参照试剂盒提供的步骤操作进行，具体操作步骤如下：(1)取烟草新鲜叶片组织0.1g，加入液氮充分研磨，每个样品3个重复。(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验先加β-巯基乙醇，使终浓度达0.1％)，迅速颠倒混匀后，65℃温育20min，期间颠倒混匀3-4次。(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min.(4)取上清液转入一新的离心管中，加入700μL缓冲液GD2，充分混匀。(5)将混匀的液体转到吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，弃掉废液。(6)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液。(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液。(8)重复步骤(7)。(9)将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附柱中的漂洗液。(10)将吸附柱置于另一干净的离心管中，加入100μL TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，得到的溶液即为DNA溶液。

目前所运用的DNA提取方法大体表现为操作繁琐需要，需多种成分使细胞裂解破碎，内含物释放，再经过抽提，一般需用氯仿等有机溶剂除去蛋白质和多糖等杂质，乙醇沉淀等操作步骤，大体都表现为时间长，完成一次提取要3.5个小时左右，价格昂贵，每个样品的费用在1美元左右，且DNA得率较低，用于简单的检测还可以，若用于大批量的检测则需要再次提取，这样不但耽误了实验进程，还会增加更大的工作量。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提出了。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：

一种提取基因组DNA的提取液，由以下组分组成：

(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，还含有0.75％(w/v)PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)和0.36％(w/v)按等重量混合的NaHSO₃/Na₂S₂O₃混合物。

一种如上所述的提取基因组DNA的提取液的用途，所述提取液用于提取烟草基因组DNA。

一种快速高效提取烟草基因组DNA的方法，具体的步骤如下：

(1)取烟草的幼嫩叶片组织0.1g于无菌离心管中，加液氮研磨至粉末状，每个样品3个重复；

(2)每管加入600μL预热DNA提取缓冲液(0.1M Tris、1M KCl、10mM EDTANa₂，pH＝9.5)，同时附加0.75％(w/v)PVP(Polyvinylpyrrolidone，聚乙烯吡咯烷酮)和0.36％(w/v)NaHSO₃/Na₂S₂O₃，摇匀后于65℃水浴45min，期间颠倒混匀3-4次；

(3)加入200μL 5M(pH＝5.8)KAC，摇匀后室温静置15min待反应充分后，13000rpm离心10min；

(4)将上清液转入另一新的无菌离心管，加入165μL预冷的异丙醇，-20℃放置30min，可见絮状沉淀；

(5)将上述离心管中溶液11000rpm离心8min，弃废液留沉淀；

(6)用500μL的70％乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，11000rpm离心3min，弃废液；