[发明专利]一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子及应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种内耳祖细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标志分子鉴定小鼠内耳祖细胞的新型方法，该标记分子能特异性地鉴定分离和培养的内耳祖细胞。

(二)背景技术

哺乳动物内耳的前庭和耳蜗中存在内耳干细胞，内耳干细胞具有自我更新和多分化多潜能性，可以分化为感觉前体细胞、神经前体细胞以及非感觉前体细胞等三种不同类型的细胞。感觉前体细胞又称为内耳祖细胞。

内耳干细胞在特定的分化条件下可以分化为内耳祖细胞，内耳祖细胞可以在不同的诱导条件下进一步分化产生不同类型的细胞，包括毛细胞、支持细胞和神经元等。将内耳干细胞接种在多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，无血清贴壁培养7天之后，RT-PCR和免疫荧光检测表明分化之后的细胞表达内耳祖细胞相关基因和蛋白。将诱导分化7天之后的祖细胞进一步进行诱导分化。至第14天时，RT-PCR和免疫荧光检测表明诱导分化后有部分细胞表达毛细胞的特异性基因和蛋白。诱导产生的毛细胞可以特异性吸收小分子染料FM1-43，全细胞膜片钳检测发现其具有功能。内耳祖细胞是内耳毛细胞的前体细胞，在治疗感音性耳聋方面具有重要的应用价值。

但是到目前为止，对内耳祖细胞的研究依然非常稀少。这主要是由于内耳祖细胞的种子细胞即内耳干细胞的分离、培养以及纯化存在一定的困难；内耳干细胞体外诱导分化为祖细胞的成功率较低等原因造成的。目前用来鉴定内耳祖细胞的基因主要包括Pax-2及Pax-8，但是这两种基因在内耳干细胞和毛细胞的早期都有表达。同时这些基因还缺乏组织特异性，它们在其它的组织中也有表达。因此，到目前为止还缺乏针对内耳祖细胞的特异性分子标志。这对内耳祖细胞的分离、纯化以及鉴定造成了一定的困难。也是内耳祖细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种组合式细胞标记分子，并采用这种组合式细胞标记分子特异性地鉴定小鼠内耳祖细胞的方法。本发明是通过分离得到小鼠内耳耳蜗基底膜上的干细胞，在体外进行无血清悬浮培养获得克隆的小鼠内耳干细胞。将内耳干细胞无血清贴壁培养7天，诱导分化形成内耳祖细胞。提取小鼠内耳祖细胞的核糖核酸(RNA)进行小鼠基因表达谱芯片检测小鼠内耳祖细胞基因表达谱，然后筛选特异性候选基因。最后从新生P0天小鼠中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，通过RT-PCR对候选的目的基因进行特异性检测，确定小鼠内耳祖细胞的特异性组合式细胞标记分子。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子，所述的标记分子为Npr3(核苷酸序列见序列7所示)、Ucma(核苷酸序列见序列8所示)和Ogn(核苷酸序列见序列9所示)。

本发明还提供一种所述检测小鼠内耳祖细胞的标记分子的应用，所述的应用为：从内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞群体中分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Npr3正向引物和Npr3反向引物，Ucma正向引物和Ucma反向引物，Ogn正向引物和Ogn反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Npr3正向引物和Npr3反向扩增产物708bp，Ucma正向引物和Ucma反向引物扩增产物181bp，且Ogn正向引物和Ogn反向引物扩增产物257bp，则单细胞为小鼠内耳祖细胞；

Npr3正向引物：5’-GGACGACATAGTGCGCTACA-3’；

Npr3反向引物：5’-TCTTCTAGGCCACATGATTTGC-3’；

Ucma正向引物：5’-TATGCTACAGGAGGGGACCA-3’；

Ucma反向引物：5’-CCTCTGTCTGTTTTCCGCATT-3’；

Ogn正向引物：5’-CCTGCTACTCTTCGTGCCTC-3’；

Ogn反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。

本发明所述内耳祖细胞按如下步骤获得：

(1)内耳干细胞分离和成球培养

解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养5-6天，形成内耳干细胞球。

本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、Abcg2、BMP-4及BMP-7等基因。