[发明专利]一种DNA捕获探针的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于核酸探针制备领域，具体涉及一种DNA捕获探针的制备方法及应用。

背景技术

传统桑格测序利用DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的不同颜色荧光标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过毛细管电泳分离大小不同的片段，观察不同大小片度的荧光标记来推断序列。

第二代测序技术主要采用边合成边测序的方法，首先利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。这些文库中的接头附着在固相表面，并在表面进行桥式PCR扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都在各自位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。测序反应过程中，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP(如同Sanger测序法)。这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并由光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

自2005年诞生以来，第二代测序技术展示了广阔的应用前景。通过测序科学家可以看到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。在进化领域科学家通过群体多态性分析探索物种之间的进化模式；在微生物领域DNA测序分型已被证明快捷而准确；而在医学领域基因组重测序在发现SNP与重大疾病的关系方面有着重要的意义。

由于往往只对基因组特定区域(比如外显子组)而不是全基因组感兴趣，因此会利用基因捕获探针对特定的区域进行捕获，对捕获出的DNA序列进行测序。探针制备是捕获测序中关键环节，目前常用的探针制备方法主要采取“瓦片式覆盖设计，人工合成碱基”的方式。具体方法是：针对感兴趣的区域设计一定长度的探针序列，每个序列沿着基因位置移动一定距离。然后采用人工合成的方式大量合成上述序列。典型的代表有中国专利《一种线粒体病基因的筛查方法》(CN 101270390 A)，针对感兴趣的区域中的非重复区域设计60bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间挪动3bp，实现对目标区域的瓦片式覆盖；然后采用原位合成技术大量合成探针。另外文献[Calvo SE,Compton AG,Hershman SG,Lim SC,Lieber DS,Tucker EJ,Laskowski A,Garone C,Liu S,Jaffe DB et al:Molecular diagnosis of infantile mitochondrial disease with targeted next-generation sequencing.Science translational medicine 2012,4(118):118ra110]中也采用了类似的思路，只是探针长度和挪动距离有所改变。

“瓦片式覆盖设计，人工合成碱基”方法最大的缺陷是成本过于高昂，且随着目标区域的增大，探针合成成本急剧上升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA捕获探针的制备方法及应用，可以降低探针制备成本。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。

一种DNA捕获探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)针对基因组中感兴趣区域设计特异的扩增引物，利用扩增引物扩增所述感兴趣区域得扩增产物；

(2)采用超声处理的方法将所述扩增产物打断为DNA片段；

(3)对DNA片段进行生物素标记；

(4)经过步骤(3)后，从所述DNA片段中分离得到标记有生物素的DNA单链，得DNA捕获探针。

所述感兴趣区域为人线粒体DNA。