[发明专利]鞘氨醇单胞菌的虾青素合成酶及其编码基因和鞘氨醇单胞菌遗传操作的方法

权利要求书

1.鞘氨醇单胞菌的虾青素生物合成途径中的GGPP合成酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

2.权利要求1所述的GGPP合成酶的编码基因，其特征在于：核苷酸序列SEQ ID NO.14所示。

3.权利要求1所述的酶或权利要求2所述的编码基因在生产虾青素中的应用。

4.一种生产虾青素的方法，其特征在于包括如下步骤：将产虾青素质粒中的crtE基因替换为权利要求1所述的GGPP合成酶的编码基因；再将基因替换后的质粒转化到大肠杆菌中，通过诱导表达生产虾青素；

所述的产虾青素质粒为pFZ153，其构建包括如下步骤：

(1)大肠杆菌来源的idi基因通过PCR扩增克隆到载体pET28a(+)上获得质粒pGZI，将idi基因片段从pGZI中用NdeI和XhoI切下插入到pETduet-1相应位点获得pFZ87；

(2)以pFZ87为模板用引物PagCrtY-Idi-R和PagCrtW-pETduet-F扩增质粒骨架；

从CGMCC 1.2244基因组DNA扩增crtY和crtZ，引物分别为Idi-PagCrtY-F、CrtZ-PagCrtY-R，CrtY-PagCrtZ-F、CrtW-PagCrtZ-R；

合成SEQ ID NO.27所示的CrtW，以其为模板用引物CrtZ-BreCrtW-F和BreCrtW-R扩增crtW；

crtY、crtZ、crtW和质粒骨架四个片段用Giboson方法连接获得pFZ152；

(3)将合成序列分别如SEQ ID NO.28、29、30所示的crtE、crtB和crtI，将crtE、crtB和crtI分别克隆到pET28a(+)的NdeI和EcoRI位点获得pFZ21、pFZ22和pFZ23；

(4)以构建pFZ152同样的方法分别以pFZ87、pFZ21、pFZ22、pFZ23为模板用引物PETduet-NcoI-R、pETduet-EcoRI-T7-F，Duet-PanCrtE-F、PanCrtI-CrtE-R，PanCrtE-CrtI-F、PanCrtB-CrtI-R，PanCrtI-CrtB-F、Duet-EcoRI-PanCrtB-R扩增质粒骨架，crtE，crtI和crtB，用Giboson方法连接获得质粒pFZ112；

(5)将crtE-crtI-crtB用NdeI和EcoRI从pFZ112上切下插入到pFZ152对应的位点获得pFZ153；

上述各引物序列如下：

PagCrtY-Idi-R:CAGATCATACCGCGGCATAGTGTAATCCTCCTTTATTTAAGCTGGGTAAATG，

PagCrtW-pETduet-F:CTTATGGCGTGGTGAGAGCTAACTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGC，

Idi-PagCrtY-F:ACCCAGCTTAAATAAAGGAGGATTACACTATGCCGCGGTATGATCTGATTC，

CrtZ-PagCrtY-R:GCATTCCAAATCCACAACATATAGTAATCCTCCTTCATTGCATCGCCTGTTGAC，

CrtY-PagCrtZ-F:CAGGCGATGCAATGAAGGAGGATTACTATATGTTGTGGATTTGGAATGCCCTGA，

CrtW-PagCrtZ-R:CCACTGCGGCGGTCATTACTCATTCCTCCTTTACTTCCCGGGTGGCGCGTC，

CrtZ-BreCrtW-F:CGCCACCCGGGAAGTAAAGGAGGAATGAGTAATGACCGCCGCAGTGGCAGAG，

BreCrtW-R:GCGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAGCTCTCACCACGCCATAAG，

PETduet-NcoI-R:CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC，

pETduet-EcoRI-T7-F:TAACTAGTGAATTCGAGCTCGGCGCGCCTG，

Duet-PanCrtE-F:GAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCGTGTGTGCGAAAAAAC，

PanCrtI-CrtE-R:TCACCGTGGTCGGTTTCATGGTTAATTCCTCCTTTACGACACCGCTGCCAG，

PanCrtE-CrtI-F:CTGGCAGCGGTGTCGTAAAGGAGGAATTAACCATGAAACCGACCACGGTGA，

PanCrtB-CrtI-R:TCAGCAGGGACGGATTATTCATGAGTATTACCTCCTTTAAATCAGGTCTTCCAGCATC，

PanCrtI-CrtB-F:GATGCTGGAAGACCTGATTTAAAGGAGGTAATACTCATGAATAATCCGTCCCTGCTGA，

Duet-EcoRI-PanCrtB-R:TTGTCGACCTGCAGGCGCGCCGAGCTCGAATTCACTAGTTAAACGGGGCGCTGCCAGAG。