[发明专利]一种百日咳诊断试剂盒及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，特别是涉及一种百日咳诊断试剂盒及制备方法。

背景技术

百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，临床表现为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故称百日咳。百日咳的咳嗽已经发现可以导致结膜下出血，肋骨骨折，尿潴留，疝，咳嗽后晕厥，以及椎动脉夹层，剧烈的咳嗽可以导致胸膜破裂，导致气胸，尤其是对小儿来说，危害很严重，痉咳期的长短与治疗的迟早有关，尽早诊断才能尽早治疗，所以对百日咳的快速诊断显得尤为重要。

目前，医学上对百日咳的检查有多种方法，包括白细胞计数法，细胞培养法，荧光抗体染色法，血清学检查等，细胞培养法通过分离菌落，观察菌落形态，只能作为初步诊断；荧光抗体染色法是用鼻咽拭子涂片，加荧光标记的抗血清，荧光显微镜下检查，早期患者75～80％阳性，优点是可以快速诊断，但缺点是特异性差，有假阳性，临床上只是作为辅助培养；血清学检查是做双份血清凝集试验及补结合试验，若抗体效价递升即可确诊，近期有用酶联免疫吸附试验测IgM、IgG和IgA抗体，对早期诊断有所帮助；另外，百日咳杆菌或其组成成分的检测方法如斑点杂交法、PCR法、组织细胞培养的形态、酶的活力等尚处于实验室或临床观察阶段，还未被普遍应用。

百日咳杆菌初步诊断以分离培养为主，潜伏期(卡他期)分离阳性率可达91.5％,而恢复期仅有约26％，确诊是用分离菌与Ⅰ相免疫血清作血清玻片凝集或免疫荧光染色，所以主要局限在Ⅰ相期检测，检测限较短。所以，急需研究出一种不仅快速而且检测限较长的百日咳杆菌检测方法。

发明内容

针对上述现状，本发明解决的技术问题就是提供一种可以快速检测百日咳杆菌的检测方法，而且检测限比较长，从患病的潜伏期、痉挛期直到恢复期均可进行有效检测。

本发明的技术方案为：一种百日咳诊断试剂盒，包括纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针、百日咳杆菌荚膜抗原、斑点金免疫集中渗滤装置，所述的集中渗滤装置由塑料小盒、点加了百日咳杆菌荚膜抗原的硝酸纤维素膜和吸水垫三部分组成。

进一步地，所述的用于浸泡检测探针的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的浓度为0.92-1.86μg/mL。

进一步地，所述的百日咳杆菌荚膜抗原浓度为0.85～1.65μg/mL。

其中，所述的百日咳杆菌荚膜抗原采用如下方法制备得到：

(1)细菌分离培养：用马铃薯血液甘油琼脂培养基培养百日咳杆菌，5-7日后，停止培养，分离菌落；由于百日咳杆菌为专性需氧细菌，初次分离培养时营养要求较高，所以需用马铃薯血液甘油琼脂培养基(即鲍～金氏培养基)才能生长，经37℃2～3天培养后，可见细小、圆形、光滑、凸起、银灰色、不透明的菌落，周围有模糊的溶血环，液体培养呈均匀混浊生长，并有少量粘性沉淀；

(2)溶菌酶处理细菌悬液：在每毫升含2亿个细菌细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶，27-35℃，保温15min，破碎细菌细胞；

(3)抗原提取：用氢作为溶剂，0.03-0.05mol/L的磷酸盐作为缓冲液，进行提取，温度控制在5℃以下，pH控制在5.0-7.0范围内；

(4)抗原分离与纯化：用离子交换法进行分离，其中，所述交换剂为离子交换凝胶，优选DEAE-葡聚糖凝胶或CM-葡聚糖凝胶；离子交换凝胶不仅交换当量高，而且层析条件温和，操作简单；

(5)抗原浓缩：采用冰冻法进行浓缩，先将步骤(4)制备的抗原冷却成固体，然后再缓慢溶解，不含抗原的纯冰晶浮于液面，抗原则集中于下层溶液中，移去上层冰块，再次用稀释液调节浓度至0.85～1.65μg/mL，即得抗原浓缩液，-20～-4℃保存；冰冻法是蛋白质一类生物大分子浓缩得比较有效的方法，利用溶剂与溶质溶解点的差别而达到出去大部分溶剂的目的；

(6)抗原包被硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜上放入调节好浓度的百日咳杆菌荚膜抗原溶液中，静置20-30min，待硝酸纤维素膜充分吸附百日咳杆菌荚膜抗原，取出，低温保存备用。

其中，所述的纳米金标记鼠抗人IgA抗体的检测探针的制备方法包括如下步骤：

(1)制备纳米金体系：王水浸泡容器，再经超纯水冲洗，烘干，加入质量浓度为1％的氯金酸，用超纯水溶解，所述氯金酸与超纯水之间的比例为：(97.5-98.8)：(3.85-4.05)，搅拌加热煮沸，加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠，继续搅拌加热至形成酒红色溶液，搅拌冷却，得到纳米金溶液；所述的纳米金粒子粒径为14-18nm；