[发明专利]一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程与产前诊断领域，涉及一种直接对脐血、羊水或外周血进行扩增的方法。 

背景技术

在产前诊断中，高危、高龄以及具有不良孕产史、遗传病家族史的孕妇来说，羊膜腔穿刺结合胎儿染色体核型分析和脐带穿刺结合脐血染色体核型分析是全世界最经典的诊断方法，但该方法需经过细胞培养富集特定的胎儿细胞，非常耗时耗力，病人等待报告的周期长。因此，临床上需要不经过细胞培养直接进行遗传病诊断的方法，如全基因组测序技术、比较基因组杂交技术(arrayCGH)，但相对于检测方法所需样本量来说，羊水及脐血中胎儿遗传物质较少，需要对遗传物质进行放大。另外，遗传病诊断前需对家系中的先症者或父母双方进行致病位点的寻找及确定，因此常抽取家系成员的外周血进行分析，同样需要对遗传物质进行扩增。聚合酶链式反应(PCR)技术是一种有效的体外扩增目的基因技术，它能在短时间内将少量的胎儿遗传物质进行扩增放大，即将靶DNA扩增百万倍，直接或者与其它技术结合后用于基因诊断和染色体病诊断。但一般步骤是从1‐3ml脐血样本或外周血样本、10‐20ml羊水样本中提取DNA后，再进行PCR扩增，DNA提取的方法有酚氯仿法、尿素法、柱提取法等，提取过程中通常要用到一些特定的试剂和复杂的步骤，尽管现在一些商品化的DNA纯化试剂盒大大地简化了这个过程，但仍然费时、费力，难于自动化，费用也增高，同时也容易产生核酸之间的交叉污染，更重要的是羊水以及血液样品中可能存在的各种致病菌，甚至病毒等，对操作人员的健康会造成很大的威胁。当孕妇由于多种原因，如羊水量少、脐带位置不好或胎儿不配合，导致获取的脐血或羊水样本量少，或者由于新生儿抽血困难获得血量较少等，这种提取DNA后再扩增的方法更是不方便或不可行。如不经DNA提取直接利用脐血、羊水或外周血进行扩增，可大大节约实验时间和检测成本，也可避免样本间的交叉污染，将会有很广阔的应用前景。 

由于体液中存在一些成分干扰了细胞的裂解，抑制了DNA聚合酶的活性，因此给直接运用脐血、羊水或外周血进行PCR扩增带来了难度，另外，脐血或外 周血中的抗凝剂也影响PCR扩增。Al‐soud研究小组发现血液中对PCR扩增的主要抑制物质是免疫球蛋白G(IgG)【Al‐Soud WA,Jonsson LJ,Radstrom P.Identification and characterization of immunoglobulin G in blood as a major inhibitor of diagnostic PCR.J Clin Microbiol,2000,38:345‐50】，将纯化的IgG(PIgG)与模板DNA一起加热后发现PCR扩增受到阻碍。之后研究又发现红细胞中的血红蛋白和白细胞中的乳铁蛋白也是人血细胞中的两种主要的PCR抑制剂【Al‐Soud WA,Radstrom P.Purification and characterization of PCR‐inhibitory components in blood cells.J Clin Microbiol 2001；39:485‐93.】。抑制剂与基因组DNA之间的相互作用阻止了DNA聚合酶与DNA模板之间的结合和延伸反应的发生，影响了PCR的扩增，给直接利用脐血或外周血进行PCR扩增带来了难度。