[发明专利]一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白及其制备方法，尤其是涉及一种TAT-BH3-NΔ19RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

自从Leffers等人发现RhoGDI2以来，人们对它的认识与日俱增。近年来，RhoGDI2与癌症的关系逐步为人们所知。RhoGDI2是RhoGDI家族成员之一，在抑制Rho家族的活性方面起着重要的调控作用。研究发现，RhoGDI2在膀胱癌，肺癌和霍奇金淋巴瘤中是下调的，并且参与细胞的凋亡过程。RhoGDI2有两个caspase家族裂解位点。在凋亡过程中，NΔ19 RhoGDI2是RhoGDI2的N端缺乏前19个氨基酸的残基。NΔ19 RhoGDI2是caspase-3的裂解产物，并向细胞核迁移，起着诱导细胞凋亡的作用。而BH3结构域普遍存在于Bcl-2家族成员中，对介导促凋亡成员与抑凋亡成员的结合及促凋亡成员的促凋亡活性起重要作用。目前，NΔ19 RhoGDI2的研究主要侧重于其抑制肿瘤生长与转移的机制，而关于通过运用基因工程技术将TAT穿膜肽、促凋亡短肽BH3和NΔ19 RhoGDI2进行融合表达，以期促进癌细胞凋亡，提高肿瘤抑制效果，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种纯度高、具有肿瘤抑制作用的TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白，为TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串连在NΔ19 RhoGDI2的N端形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的促凋亡短肽BH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的NΔ19 RhoGDI2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)构建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒；

(2)利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白；

(3)分离纯化eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白。

步骤(1)所述的构建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒具体包括以下步骤：

a.以序列如SEQ ID NO：6所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：7所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，PCR反应，获得TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因；

b.用基因纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将目的基因和pPAL7/eXact表达质粒用BamH I和HindIII进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆送样测序。

所述的PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，循环30次，最后72℃延伸5min。

步骤(2)所述的利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：

将测序正确的含有pPAL7/eXact-BH3-TAT-NΔ19 RhoGDI2重组质粒的大肠杆菌BL21在含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导4h，异源表达eXact-BH3-TAT-NΔ19RhoGDI2融合蛋白。

步骤(3)所述的分离纯化eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：