[发明专利]一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，为TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串连在NΔ19 RhoGDI2的N端形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的促凋亡短肽BH3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述的NΔ19 RhoGDI2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，编码该融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

4.一种如权利要求1～3任一所述的TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)构建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒；

(2)利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白；

(3)分离纯化eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的构建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒具体包括以下步骤：

a.以序列如SEQ ID NO：6所示的上游引物和序列如SEQ ID NO：7所示的下游引物为反应引物，以全长的RhoGDI2基因为模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，PCR反应，获得TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的编码基因，即目的基因；

b.用基因纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，将目的基因和pPAL7/eXact表达质粒用BamH I和HindIII进行双酶切，T4连接酶连接后，获得pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2重组质粒，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，挑选阳性克隆送样测序。

6.根据权利要求5所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述的PCR反应的条件是：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，循环30次，最后72℃延伸5min。

7.根据权利要求4所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的利用大肠杆菌BL21异源表达eXact-TAT-BH3-NΔ19RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：

将测序正确的含有pPAL7/eXact-BH3-TAT-NΔI9 RhoGDI2重组质粒的大肠杆菌BL21在含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养基中37℃培养，当OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃诱导4h，异源表达eXact-BH3-TAT-NΔ19RhoGDI2融合蛋白。

8.根据权利要求4所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述的分离纯化eXact-TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白具体包括以下步骤：

在上样过程中，Profinity eXact纯化系统中固定化的枯草杆菌蛋白酶识别并亲和带eXact标签的蛋白质，随后加入洗脱缓冲液，使枯草杆菌蛋白酶切断融合蛋白上的标签，最终得到仅带有自身天然氨基酸序列的高度纯化的目标蛋白，即TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白。

9.一种如权利要求1～3任一所述的TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的应用，其特征在于，所述的TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白用于抑制癌细胞的增殖和侵袭。

10.根据权利要求9所述的一种TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白的应用，其特征在于，所述的癌细胞包括膀胱癌T24细胞、肺癌A549细胞及膀胱癌UM-UC-3细胞。