[发明专利]一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，俗称玻璃尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β(1-3)和β(1-4)糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏性多糖，1934年由Meyer等人从牛玻璃球眼中首次提取获得，广泛用于医药、化妆品、食品等领域。研究表明，分子量对透明质酸的活性有很大影响，不同分子量的透明质酸甚至表现出截然相反的活性。

透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子，由于HA具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，同时无任何免疫原性和毒性，被广泛应用于化妆品、食品和医药等行业领域。

根据文献研究表明，分子量大小对HA的生物活性影响较大，不同分子量范围的HA表现出截然不同的生理学功能。高分子量的HA(Mr>2×10⁶)由于具有较好的粘弹性、保湿性、抑制炎性反应、润滑等功能，可应用于高端化妆品行业、眼科手术黏弹剂和关节腔内注射治疗。中等分子量的HA(介于1×10⁵-10⁶)具有良好的保湿性、润滑和药物缓释作用，可广泛用于化妆品、滴眼液、皮肤烧伤愈合及术后防粘连。低分子量的HA和寡聚透明质酸，表现出非常强的生物活性，具有抑制肿瘤扩散、促进创伤愈合、促进骨和血管生成、免疫调节等作用，且易于渗透到真皮中，免疫细胞、细胞因子的激活剂。因此，小分子透明质酸在食品保健、化妆品以及临床医疗领域具有广阔的应用前景。

制备小分子量的方法有物理降解法、化学降解法、酶解法。物理法主要为加热、机械剪切力、紫外线、超声波、⁶⁰Co照射、γ-射线辐射等方法促使HA发生降解。物理降解法处理过程简单，产品易于回收。但是，这些方法都会带来一定的影响，例如加热法易使HA变色，紫外和超声效率较低等，且产生的小分子分子量范围较大，产品稳定性较差。HA的化学降解方法有水解法和氧化降解法，水解法分酸水解(HCl)和碱水解(NaOH)，氧化降解常用的氧化剂为次氯酸钠(NaClO)和过氧化氢(H₂O₂)。但化学降解法引入了化学试剂，反应条件复杂，易给HA性质产生影响和给产品的纯化带来困难，且产生大量的工业废水。酶解法是透明质酸在透明质酸酶的作用下，糖链上的糖苷键发生断裂，但通常酶解的成本很高，不适合大规模的工业生产。

本发明为解决制备小分子HA的问题，采用生物酶法催化降解HA，产生分子量范围均一的小分子透明质酸。由于生物酶法反应条件温和、专一性高、且产品纯度高，实现了工业化生产制备小分子透明质酸。

发明内容

本发明公开了一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸的方法，是向水中加入高分子透明质酸和透明质酸酶，控制不同反应时间制备不同分子量(聚糖单位)的小分子透明质酸，实现工业化生产。

编码所述透明质酸酶的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示的序列。

所述高分子HA的分子量是10⁴kDa以上。优选2.212×10¹⁴Da。

所述方法优选在带有自动温控和搅拌装置的发酵罐中进行。

所述方法的反应体系优选含有透明质酸酶1×10⁶U/L-4×10⁸U/L和高分子透明质酸2-100g/L，在10℃-65℃，400-1000rpm搅拌速度条件下反应1-13h，制备平均分子量在4000Da至370000Da的透明质酸。

进一步优选含有透明质酸酶3×10⁷U/L和高分子透明质酸40g/L，在45℃，700rpm搅拌速度条件下反应不同时间制备不同分子量的透明质酸。

为制备出平均分子量为370000Da的透明质酸，反应时间优选1小时。为制备出平均分子量为80000Da的透明质酸，反应时间优选2.5小时。为制备出平均分子量为30000Da的透明质酸，反应时间优选3.5小时。为制备出平均分子量为9000Da的透明质酸，反应时间优选7小时。为制备出平均分子量为4000Da的透明质酸，反应时间优选12.5小时。