[发明专利]番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种活力菌体的计数方法，特别是涉及一种番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法，属于微生物学与植物保护学交叉领域。

背景技术

番茄溃疡病是番茄生产中最为严重、具有毁灭性的病害之一。该病于1909年在美国密执安州的温室番茄上首次发现。20世纪30年代、60年代、80年代，该病先后在美国中西部地区、北卡罗来那州及加拿大安大略地区大流行，造成的产量损失最高达80％以上。1943-1946年期间，该病在英国大流行，使番茄罐头产业受到严重影响。目前，世界上60多个国家报道了该病的发生危害，遍及美洲、欧洲、亚洲、非洲和大洋洲。

我国于1954年首次有番茄溃疡病的记载。目前，该病害在北京、天津、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、新疆、甘肃、宁夏、青海、四川、云南、广西、海南、河北、山西、山东、河南、安徽、上海等省、市、自治区都有发生，番茄产业受到了不同程度的影响。2007年该病原菌被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

目前，生产上常用铜制剂或抗生素来防治番茄溃疡病，但效果并不理想。开展种子健康检测，从源头上控制带菌种子进入生产环节，或是在生产中及早发现并清除病株，是防治番茄溃疡病的有效手段。因此，快速、特异性定量检测有活力的番茄溃疡病菌是种子带菌检测的关键，也是生产中亟待解决的问题。

在当前种子或植物材料携带有活力番茄溃疡病菌的检测中，基于选择性培养基分离培养的Bio-PCR方法是被广泛采用的标准方法，但该方法不能用于检测处于损伤(injure)状态或不可培养(viable but non-culturable，VBNC)状态的番茄溃疡病菌，因此可能造成假阴性的结果，给生产带来潜在风险。

流式细胞术结合Live/Dead BacLight试剂盒的方法能够区分细菌的活细胞和死细胞。该方法将两种核酸染料SYTO9和碘化丙啶(PI)混合使用，对细菌菌体进行染色，判断细胞的活性，其原理是SYTO9可以穿过完整的细胞膜，进入菌体内与核酸结合而呈现绿色荧光。PI只能通过破损的细胞膜进入菌体结合核酸而呈现红色荧光。若使用SYTO9和PI对细胞进行双染，呈现绿色荧光的细胞则为有活性的细胞。随后，将染色后的细菌经过流式细胞仪计数，从而实现定量检测有活力的细菌菌体。但由于番茄溃疡病菌菌体较小、细胞壁偏厚，使用现有的试剂盒并按照说明书提供的方法，并不能很好地区分有活力和失活的菌体。因此，在现有方法的基础上通过研究和改进，筛选和调整染料和染色方法，获得有活力番茄溃疡病菌的计数方法，实现对该病原菌有活力菌体的快速计数，对在生产中控制番茄溃疡病的传播蔓延和发生危害具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄溃疡病菌有活力菌体的流式细胞术计数方法。

本发明提供一种检测待测样品中有活力菌体的方法，包括如下步骤：将待测样品进行SYTO9染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的总细胞数或总细胞浓度；将待测样品进行PI染色，使用绝对计数管计数，得到待测样品的死细胞数或死细胞浓度；用待测样品的总细胞数减去待测样品的死细胞数得到待测样品中有活力菌体的细胞数，或，用待测样品的总细胞浓度减去待测样品的死细胞浓度得到待测样品中有活力菌体的浓度。

上述方法中，所述使用绝对计数管计数是采用流式细胞仪结合绝对计数管进行计数的。

上述任一所述的方法中，所述流式细胞仪的FSC电压模式为E00，SSC电压为440V，放大模式为Log型，进样速度为中速。

上述任一所述的方法中，所述将待测样品进行SYTO9染色，使用绝对计数管计数时，流式细胞仪检测时以FL1(530/30nm)作为检测通道，电压为640V。

上述任一所述的方法中，所述将待测样品进行PI染色，使用绝对计数管计数时，流式细胞仪检测时以FL2(585/42nm)作为检测通道，电压为625V。

上述任一所述的方法中，所述待测样品中菌的浓度为10⁵-10⁷CFU/ml。

上述任一所述的方法中，所述SYTO9染色时SYTO9在所述待测样品中的浓度为50μmol/L；

所述SYTO9染色时染色时间为20-40min，具体为30min。

上述任一所述的方法中，所述PI染色时PI在所述待测样品中的浓度为150μmol/L；

所述PI染色时染色时间为30-60min，具体为50-60min，再具体为60min。

上述任一所述的方法中，所述菌为番茄溃疡病菌。