[发明专利]一种用于扩增子测序的建库方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种用于扩增子测序的快速建库方法。

背景技术

随着高通量测序技术的发展，测序成本的降低，使测序技术逐渐成为基础生物学研究和医学检测的常规实验方法。从人类基因组计划构建了第一个基因组图谱开始，新一代测序技术通过全基因组测序构建了大量常规物种的基因组图谱，也促进了测序技术的高速发展。但全基因组测序结构复杂，数据量大，周期长，费用高，限制了它的发展。

同时，有的研究者只对特定的基因组区域感兴趣，这时就只需对相应区域进行测序研究，不需要对全基因组进行测序。扩增子测序(Amplicon Sequencing)就是只对目标区域进行测序研究的一项测序方法。通过设计感兴趣的基因组区域的引物，进行PCR扩增，对目标区域进行富集，然后针对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行建库，高通量测序，分析序列中的变异。扩增子测序能根据研究者目的，针对目标区域进行高覆盖度的测序，还可以检测到低频突变。采用扩增子测序，研究者可以对基因组中感兴趣的关键区域进行重点研究。这种高针对性的方法可以高效的发现，验证和筛选关注区域的基因组变异。相比全基因组测序，扩增子测序对目标区域有更准确快速的研究，适用于大量样本的特定基因组区域研究。

目前的扩增子测序都是通过常规的建库方法，在通过PCR扩增富集到目标区域后，进行混样，然后进行末端修复和加A，再加接头，纯化样品，跑胶回收目的条带，然后PCR扩增，最后再跑胶回收主带，该种常规的建库方法步骤繁琐，浪费时间，工作量大，不利于大量样品的测序建库。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于扩增子测序的快速建库方法，以简化扩增子测序中建库步骤的操作过程，降低扩增子测序建库的时间和成本，同时保证不影响测序质量。

本发明所提供的用于扩增子测序的建库方法包括以下步骤：

(1)PCR扩增富集目标区域：对待测样品基因组DNA，针对目标区域设计引物序列，该引物序列在正向引物和反向引物的5’端设有随机碱基序列和接头序列，进行PCR扩增，回收PCR产物；

(2)PCR扩增引入测序接头：将步骤(1)所得到的PCR产物进行混样，设计引物序列，该引物序列包含与步骤(1)中的接头序列互补的序列，对混样进行PCR扩增，回收PCR产物，即得到用于扩增子测序的DNA文库。

本发明的用于扩增子测序的建库方法，在步骤(1)之前还包括提取待测样品基因组DNA的步骤，该提取步骤可采用本领域内常规方法进行，例如使用Omega公司的SOIL DNA KIT进行提取；此外，在步骤(2)之后还包括测序并对测序数据进行生物信息学分析的步骤，本发明建库后的上机测序可以通过一代测序平台进行，也可通过高通量测序平台进行，例如ABI公司的3730XL测序平台或Illumina公司的miseq测序平台等。进行生物信息学分析的步骤主要是指通过质控和barcode得到优化数据，然后聚OTU，物种注释，α多样性分析(稀释曲线、shannon曲线、物种累积曲线；chao、simpson等多样性指数)，β多样性分析(pca、pcoa聚类；系统进化树，物种分布、显著性差异、环境因子梯度分析、各种分组比较等)。

本发明所提供的用于扩增子测序的建库方法的流程图如附图1所示。

具体来说，本发明的步骤(1)进行了第一次PCR扩增，以完成富集目标区域的操作。在针对测序目标区域进行引物设计时：引物总长度≤59bp，退火温度55℃～75℃。在正向引物和反向引物的5’端设有随机碱基序列和接头序列，其中随机碱基的个数可设计为1～10个，在本发明的具体实施方式部分采用的是1～5个随机碱基的方案。接头序列是与测序仪相配套的序列，例如illumina的”Y”字型的序列。随机碱基序列和接头序列的设计主要达到以下三个方面的目的：(1)引入区分样本标签；(2)引入去除嵌合体序列标签；(3)引入测序接头，方便测序。最后，回收PCR产物时可采用凝胶电泳法切胶回收目的条带。