[发明专利]汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，涉及汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法。

背景技术

汉坦病毒(hantavirus，HV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是肾综合征出血(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)和汉坦病毒肺综合征(hantaviruspulmonarysyndrome，HPS)的病原体。此病的传染源是带病毒的宿主动物，主要为啮齿类动物，每种基因型的HV有其主要的宿主动物，其中黑线姬鼠和褐家鼠分别携带汉坦型HV和汉城型HV，是主要宿主和传染源。汉坦病毒是肾综合征出血和汉坦病毒肺综合征的病原体。随着分子生物学技术发展，对HV本质和特征研究证实HV至少包括6个血清型：汉坦病毒、汉城病毒、普马拉病毒、希望山病毒、泰国病毒和索托帕拉亚病毒等。全世界每年汉坦病毒病的发病人数为6万～10万，中国是受HV危害较为严重的国家。汉坦病毒肺综合征主要引起急性发热，进行性呼吸衰竭，病死率高达40％-60％。HV流行广泛，危害严重，已成为一个全球性的公共问题。因此，建立一种快速、特异、灵敏、定量检测汉坦病毒的方法很有必要，对汉坦病毒感染的预防控制有着非常重要的意义。

HFRS的实验室诊断一直是比较活跃的研究领域，人们一直希望从组织和标本中直接检测出病原体.用动物和细胞培养分离病毒是最为可靠的，但由于HV的分离培养对标本要求高，分离周期长(每传一代标本需观察20d～30d)，在胞内增殖不出现典型的细胞病变，需要用免疫荧光试验检测病毒的毒力和要求较高的生物安全防护等，而常常不适于大规模的流行病学调查。特别是有些试验感染HV病毒的动物，其免疫荧光的结果往往是阴性的，而将此试验动物的内脏组织制备成悬液，却可使其它的健康动物遭受感染。

目前血清学检测方法仍然是汉坦病毒的主要检测手段，用IIF检测IgM和IgG最常用。但是以往的血清学诊断方法，如间接免疫荧光试验、斑点免疫结合试验、带状免疫斑点试验等敏感性和特异性不够高，给临床诊断带来一定限制，常造成漏诊和误诊，使患者得不到及时有效的治疗。因此有必要建立一种高灵敏的、高特异的检测技术。

荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR，FQPCR)技术是近几年发展起来的新技术，既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其避免了传统PCR方法以终产物检测定量产生的偏差，提高了实验的可复性。因此实验应用TaqMan探针建立了汉城型汉坦病毒的荧光定量PCR检测方法。

现有技术一：血清学诊断是汉坦病毒感染的主要诊断方法，用IIF检测IgM和IgG最常用，酶免疫测定(ElA)检测IgM，利用核蛋白进行的IgG检测，适用于疾病的早期诊断和大量血清流行病学调查；免疫印迹敏感而特异，是一种快速的抗体检测方法，可用于区分不同汉坦病毒引起的感染。检测技术存在的问题：1，检测方法复杂，步骤繁琐，2，检测结果可能产生假阳性和难以进行定量检测。3，检测过程时间长，反应速度慢。

现有技术二：应用RT-PCR方法检测病毒，PCR法其灵敏性高，特异性好以及快速简便的优点被广泛采用。RT-PCR技术存在的问题是：1基因的高效扩增，可能产生假阳性结果和难以进行定量检测。2电泳过程中的染色剂EB(溴化乙锭)为强烈致癌物质，若操作不当，会严重危害操作者的身体健康。3定量方法都是针对PCR终产物来进行的，而PCR的平台效应在一定程度上干扰了PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。

发明内容

本发明的目的在于提供汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，解决了现有的汉坦病毒感染检测方法复杂，反应速度慢，检测精度低的问题。

本发明建立一种汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量快速检测方法，以鼠肺组织中克隆的汉城型汉坦病毒M基因片段为基础，设计特异的荧光定量PCR引物和探针，以pGM-T重组的M基因为标准品，按10倍从10⁷-10¹稀释，制作汉城型汉坦病毒的荧光定量标准曲线，建立汉城型汉坦病毒的Taqman探针荧光定量方法，该方法能够对组织样本中的汉城型汉坦病毒进行定性和定量分析，该方法检测精度高(能达到10个拷贝)，所需时间短(1.5小时内完成)。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：