[发明专利]先天性甲状腺功能减低症多基因测序引物及检测方法

权利要求书

1.一组检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：由Pax-8基因PCR引物序列、TG基因PCR引物序列、IYD基因PCR引物序列、DUOX2基因PCR引物序列、NIS基因PCR引物序列、TSHR基因PCR引物序列和TPO基因PCR引物序列中的一种或多种引物序列组成。

2.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述Pax-8基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.1—SEQ ID No.12所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述TG基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.13—SEQ ID No.72所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述IYD基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.73—SEQ ID No.82所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述DUOX2基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.83—SEQ ID No.100所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述NIS基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.101—SEQ ID No.118所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述TSHR基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.119—SEQ ID No.136所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求1所述的检测先天性甲状腺功能减低症的多基因PCR引物序列，其特征在于：所述TPO基因PCR引物序列为序列表SEQ ID No.137—SEQ ID No.166所示的核苷酸序列。

9.一种检测先天性甲状腺功能减低症的多基因测序检测方法，其特征在于：采用新一代测序对CH多个致病基因和相关基因同时进行突变检测；所述CH多个致病基因为Pax-8基因、TG基因、IYD基因、DUOX2基因、NIS基因、TSHR基因和TPO基因中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的一种检测先天性甲状腺功能减低症的多基因测序检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计多基因PCR引物序列：为序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.166中的一种或多种；

(2)提取DNA样本：用常规方法提取测试者的DNA样本；

(3)扩增目标区域：利用TAKARA高保真酶，按照25μl体系，利用美国AB Veriti梯度PCR仪,扩增30个循环，其中各基因外显子PCR扩增的热循环条件如下：

95℃预变性5min；95℃，30sec，60℃，30sec,72℃,2min30sec；30个循环，72℃延伸10min；

(4)PCR产物纯化：所有产物均取2.5μl进行电泳鉴定；所有剩余PCR产物均采用美国Omega公司过柱试剂盒进行纯化回收；

(5)文库的制备：携带测序引物片段的转座子，随机打断上述步骤的扩增产物(扩增子)，并将测序引物片段连接于片段化的扩增子(长度约为300bp)的两端进行PCR扩增，测序引物由标签序列、P5/P7序列等组成，得到可用于测序的DNA片段；

(6)miseq测序：利用MiSeq Reagent Kit(300 cycles PE)试剂盒测序，稀释文库并使其变性，制备所需的预填充试剂盒，将文库混合液装到指定槽的试剂盒中，设置实验步骤并检查各运行参数，选择Sequence开始运行，实验结束后查看测序结果；

(7)生物信息学分析

首先对新一代测序数据进行预处理，包括剪除3'端质量值低于20的序列、去除平均质量值低于20的序列；然后使用bwa将质控后的序列比对到参考基因组序列上(版本号hg19)，利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用SNPnexus工具注释SNP，找到可能性的功能性位点，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库，过滤人群中存在的多态性位点。