[发明专利]β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法，属于分析技术领域。

二、背景技术

β-隐黄质化学名3-羟基-β-胡萝卜素，是一种具有VA前体功能的含氧类胡萝卜素，主要来源于高等植物、真菌、蓝藻等，广泛分布于人体血液、肺、皮肤以及口腔粘膜等组织中。β-隐黄质具有良好的单线态氧及氧自由基清除能力，使其在抗癌、抗氧化方面的作用显著，尤其是对吸烟引起的肺癌有独特的疗效。另外β-隐黄质在预防心血管疾病、增强免疫功能等方面也具有重要作用。

β-隐黄质化学结构中含有的共轭双键和羟基使其在光照、加热和其他条件下容易发生异构化和氧化反应，并产生多种顺式异构体和氧化物。β-隐黄质全反式构象稳定性和生理活性最强，顺式和氧化结构在物化性质和生理功能上与全反式差别较大。想要避免β-隐黄质制备和应用过程中受外界环境影响产生顺式异构体和氧化物，就需要一种准确高效的定性、定量分析方法进行检测其可能发生的异构和氧化物，进而提出控制措施。

HPLC技术因为高灵敏度、快速准确等优点，在类胡萝卜素的分析测定中得到普遍应用。C30固定相具有良好的分辨率和独特的分离能力，适用于不同种类类胡萝卜素的分离鉴定。然而，实际操作中由于类胡萝卜素与其异构体的结构和极性非常接近，很难一一分离和检测。有报道选用甲醇和二氯甲烷或者甲醇和甲基叔丁基醚作为混合流动相分离叶黄素和α、β-胡萝卜素的顺式异构体，但未见有β-隐黄质双顺式异构体及酮类氧化物分离检测的相关报道。因此，建立一种β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的检测方法对β-隐黄质的生产和应用具有重要意义。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种快速、准确的β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的HPLC-MS测定方法，可以对β-隐黄质异构及氧化产物进行准确的定性和定量分析。

技术方案

本发明通过碘催化-光异构化反应制备得到β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物，应用C30-HPLC-DAD-APCI-MS联合技术对β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物进行定性及定量分析，包括以下步骤：

1、β-隐黄质单顺式、双顺式异构体及酮类氧化产物的制备

将1.0mgβ-隐黄质标准品用甲醇溶解并定容于25mL棕色容量瓶，置于超低温冰箱中待用。取6份2mLβ-隐黄质甲醇溶液于6支试管中，氮气吹干后分别加入2mL正己烷和1mL碘-正己烷溶液(1.6μg/mL)，使碘含量为β-隐黄质质量的1％～2％。将试管放在距恒温摇床中日光灯10cm处(温度25℃，光照强度1800lux)，分别照射1～5h后取出处理。用硫代硫酸钠(1×10³mol/L)洗涤去除多余的碘，氮气吹干后用2mL甲醇复溶，经0.45μm滤膜过滤后置于超低温冰箱中待测。

2、色谱及质谱条件

C₃₀-HPLC分析条件：色谱柱YMC Carotenoid C30(4.6mm×250mm，5μm)，二极管阵列检测器，流动相1.5％乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/25/70)和1.5％乙酸铵水/甲基叔丁基醚/甲醇(5/85/10)进行梯度洗脱，检测波长200～550nm，流速0.6mL/min，进样量20μL，柱温25℃。

MS分析条件：质谱条件为色谱柱流出组分进入质谱仪的流速为10μL/min，离子源APCI⁺，扫描范围80～1000m/z，毛细管电压2500V，干燥气体5L，雾化气体20psi，汽化温度300℃，蒸汽温度400℃，电晕电流4μA。

3、建立全反式β-隐黄质标准曲线

准确称取1.0mg全反式β-隐黄质标准品，用甲醇溶解并定容至50mL棕色容量瓶中，混匀，制成质量浓度为20μg/mL的标准液。分别取0.0125、0.025、0.05、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL标准液置于5mL容量瓶中，用甲醇定容并混匀，制成浓度为0.05、0.1、0.2、1、2、4、6、8、10μg/mL的系列标准溶液，每个系列浓度进样3次，以进样量为横坐标、相应吸收峰面积为纵坐标进行线性回归分析，绘制全反式β-隐黄质标准曲线。

有益效果