[发明专利]一种天然产物中铁螯合物的分离纯化方法

说明书

技术领域：

本发明涉及从链霉菌代谢产物中分离纯化获得一种铁螯合物的方法。 

背景技术：

铁对于几乎所有生物体的生长都是必须的。然而铁离子的不溶性影响生物体对其的吸收，所以自然界绝大多数情况下铁是以螯合物形式溶解，并被转运到胞浆而被吸收的。“铁螯合物”均系在三磷酸腺苷(ATP)依赖的转运系统下被主动摄取。“铁螯合物”可分为儿茶酚型、羟基氧肟酸型、羧酸类型等，它们都有一个或多个多齿配体提供多对电子与中心体(Fe3)形成配位键。无论在革兰氏阳性或阴性菌中，“铁螯合物”均系在ATP依赖的转运系统下被主动摄取。该运转系统包含有细胞特异性外膜蛋白FhuA、E，周质蛋白FhuD和一些内膜协助蛋白FhuB和C，其主动转运过程依赖于三磷酸腺苷(ATP)和TonB蛋白复合体的参与。这种跨膜内吞的主动转运机制在抗生素药物研究领域一直引起人们重视。 

白霉素(albomycin)是一个由链霉菌ATCC700974产生的含羟基氧肟酸型铁螯合物的抗生素，其铁螯合基团是通过丝氨酰肽键与硫代呋喃糖苷胞嘧啶核苷相连，其结构如(式1)所示。白霉素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，包括百日咳杆菌和螺旋体等均有良好的抗菌活性。白霉素是由FhuA主动转运通过细菌外膜，与周质蛋白FhuD结合，再经ABC运转蛋白FhuB和C进入胞质。X-衍射晶体结构研究表明，与FhuA蛋白结合的部分主要是羟基氧肟酸型铁螯合基团，后者构型的变化将影响其与FhuA蛋白的结合，而其配体分子结构的变化与蛋白结合力的影响较少，所以白霉素的抗菌活性取决于核苷部分，但其进入细菌细胞发挥作用则完全依赖于铁螯合基团的存在，脱去铁离子的白霉素完全丧失抗菌活性。这种通过特异铁运载系统进入细胞发挥生物活性的含铁螯合物抗生素被称为“木马”(Trojan horse)抗生素。除白霉素以外，链霉菌还产生如萨尔霉素(Salmycin)[Vertesy L等1995，Helvetica Chimica Acta 78(1),46]、高铁霉素 (Ferrimycin)[Bickel H等1965，Antimicrob Agents Chemother(Bethesda)5,951].和达诺霉素(Danomycin)等[Tsukiura H等1964，Journal of Antibiotics17(2),39]′。“木马”(Trojan horse)抗生素中的“铁螯合”基团不同，与其结合的分子结构也各异，它们新颖的结构和独特的作用机制在人们克服“多重耐药细菌”的战役中，受到了极大的关注。 

由于迄今发现的绝大多数抗生素均依赖被动渗透进入菌体[Nikaido H,1994Science 264(5157),382]，而抗生素如果能在“铁螯合物”的辅助下，以与“铁螯合物”相同机制被病原菌主动内吞摄取，其作用效率将会得到极大的提高。一些抗生素与“铁螯合物”的耦合物已通过化学合成方法得到，如合成的羟基氧肟酸型“铁螯合物”与beta-内酰胺类抗生素的耦合物，对耐药菌的抑菌活性显著提高，其最低抑菌浓度(MIC)可以至少降低100倍[Wittmann S等2002，Bioorg Med Chem 10(6),1659；Braun V等2009，Biometals 22(1),3]。羟基氧肟酸型“铁螯合物”与氟诺沙星的耦合物，对耐药金葡菌的MIC可达1.0μΜ。[Timothy AW等Bioconjug.Chem 2013,20:24(3):473-486]。 

白霉素中含有天然产生羟基氧肟酸型“铁螯合物”，链霉菌产生微生物天然产物种类繁多，并产生多样性活性物质，迄今临床上常用的抗生素有70％来源于链霉菌。然而，迄今为止，尚未见有从链霉菌产物中分离纯化得到“铁螯合物”的相关报道。 

本发明的目的是，提供一种从链霉菌产生的白霉素中分离纯化其“铁螯合物” 的方法，以便可以获得白霉素中的“铁螯合物”，并利用其为运转核心，与链霉菌产生的种类各异且具生物活性的分子基团耦合，以研发利于渗透细菌胞内的新型药物。 

发明内容：

本发明提供一种从链霉菌产生的白霉素中分离纯化其“铁螯合物”的方法。所述方法包括以下步骤： 

白霉素产生菌ATCC700974的培养； 

白霉素产生菌ATCC700974培养液的初步处理； 

铁螯合物的初步分离； 

铁螯合物的纯化； 

铁螯合物纯品的检测。