[发明专利]一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法。

背景技术

链霉菌属于高GC含量的革兰氏阳性细菌，是放线菌中的一个大的类群。链霉菌具有复杂的发育和分化周期，在固体培养基上呈丝状生长并产生孢子。链霉菌属的不同种中鉴定了约6000种抗生素和生理活性物质，占已报道的微生物来源药物的约一半（Berdy J. 2005. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot (Tokyo) 58(1):1-26）。天蓝色链霉菌是链霉菌研究的模式菌株，遗传背景研究相对清晰。2002年，天蓝色链霉菌完成全基因组测序（Bentley S. D, K. F. Chater, A. M. Cerdeno-Tarraga, G. L. Challis, N. R. Thomson, K. D. James, D. E. Harris, M. A. Quail, H. Kieser, D. Harper, A. Bateman, S. Brown, G. Chandra, C. W. Chen, M. Collins, A. Cronin, A. Fraser, A. Goble, J. Hidalgo, T. Hornsby, S. Howarth, C. H. Huang, T. Kieser, L. Larke, L. Murphy, K. Oliver, S. O'Neil, E. Rabbinowitsch, M. A. Rajandream, K. Rutherford, S. Rutter, K. Seeger, D. Saunders, S. Sharp, R. Squares, S. Squares, K. Taylor, T. Warren, A. Wietzorrek, J. Woodward, B. G. Barrell, J. Parkhill, and D. A. Hopwood. 2002. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature 417:141-147.），目前已经开发出商用的DNA芯片检测平台，可以对染色体水平的差异进行即时快速地分析。

构建基因缺失突变是研究微生物生理及基因功能的常用方法。由于链霉菌生长慢，常规的基因敲除方法耗时较长，不适合大规模基因缺失突变研究。转座子插入突变是一个相对快速有效的基因失活方式，可以很快建立一个覆盖全基因组的基因插入失活突变库。转座子插入缺失可以大致分为体内体外两种。2001年，Gehring等报道利用Tn5转座子对已有的天蓝色链霉菌基因组文库进行随机插入突变，建立了一个以大肠杆菌为宿主的突变文库，抽提突变文库后使用原生质体转化和接合转移等手段转入天蓝色链霉菌M145中，抗性筛选双交换后得到了一个在基因组上随机插入的突变库，平板筛选得到5个带有明显表型变化的突变株，发现了一些调控基因（Gehring A. M., Nodwell J. R., Beverley S. M., Losick R. 2000. Genomewide insertional mutagenesis in Streptomyces coelicolor reveals additional genes involved in morphological differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 97(17):9642-7.）。随后的2004年，他们用相同的方法又发现了另外一些生物合成相关的酶影响了天蓝色链霉菌M145的表型（Gehring A. M., Wang S. T., Kearns D. B., Storer N. Y., Losick R. 2004. Novel genes that influence development in Streptomyces coelicolor. J Bacteriol. 186(11):3570-7.）。该方法可以做到基因组范围内的随机突变，但是转座子的转座突变过程在大肠杆菌内完成，仍需要将突变子从大肠杆菌导入链霉菌中，影响了效率。