[发明专利]一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法

权利要求书

1.一种链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建系列重组质粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105为第一个SceS酶切位点随机导入质粒，各质粒中转座酶编码序列之前分别带有ermE启动子、neo启动子、hrdB基因启动子和tcp830诱导型启动子；

2）将所构建的重组质粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105导入天蓝色链霉菌M145，构建随机染色体大片段缺失的突变子库tn1；

3）构建系列重组质粒pTNL_102为第二个SceS酶切位点随机导入质粒，导入突变子库1，获得突变子库tn2；

4）利用大肠杆菌ET12567导入重组质粒pLu_101至突变子库tn2，通过硫链丝菌素诱导表达归巢核酸内切酶SceS，酶切染色体上随机导入的SceS酶切位点，促进染色体上随机导入的两个重叠的不完整的卡那霉素抗性基因片段发生重组，去除之间的染色体片段，通过涂布卡那霉素的方式筛选得到转座子突变子库tn3；

5）利用R₂YE平板评估大片段敲除突变子或利用质粒挽救的方法精细定位染色体删除区段。

2.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_101以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、ermE启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

3.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_103以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、neo启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

4.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_104以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、hrdB基因启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

5.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的重组质粒pTNL_105以pDZY101为模板，PCR带有整合酶、tcp830诱导型启动子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重组质粒pTNL_101上克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO1所示。

6.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤3）中，所述的重组质粒pTNL_102以pDZY101为模板，PCR带IRR和oriC的片段，随后克隆入带有oriT的壮观霉素抗性基因，最后克隆入带有sceS酶切位点的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ ID NO2所示。

7.根据权利要求1所述的链霉菌基因组DNA大片段体内随机敲除的方法，其特征在于：步骤4）中，所述的质粒挽救的方法精细定位染色体删除区段，具体过程为：限制性内切酶ApaⅠ在天蓝色链霉菌染色体上分布均匀，利用该酶酶切染色体后自连转化大肠杆菌，抗性筛选大肠杆菌并抽提质粒，测序即能精确定位敲除区段。