[发明专利]一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法，以及该方法在四膜虫多基因联合研究中的应用。

背景技术

嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)是一种单细胞真核生物，属于纤毛类原生动物，在单个细胞内集中了维持生命和延续后代所必需的一切功能，是研究蛋白功能理想的模式体系。作为研究某些人类疾病相关基因结构和功能的生物模型，四膜虫内已建立了一系列成熟的基因重组和转化技术，这些技术已经成功地通过基因敲除、过表达和突变等实现基因功能研究。近年来随着对遗传学研究的深入，人们发现生物性状往往不是由单一基因控制，而是多个基因相互作用的结果，单基因遗传研究已无法满足四膜虫蛋白组学发展的需要。因此有必要建立简便、有效的多基因共转染及共表达方法，同时对两个不同目的基因进行敲除、突变或表位标注等改造，从而通过分析被定向改造的遗传性状，进一步探讨四膜虫中两目的基因间的相互作用及功能关系。

目前，四膜虫中常用的多基因联合研究方法是通过小核转染及巴龙霉素或杀稻瘟菌素抗性筛选，分别获得小核A、B基因改造纯合细胞株，再将该两纯合株接合配对，获得具有双抗性的、纯合的大核及小核A、B基因改造细胞株(Bowen Cui，Yifan Liu，and Martin A.Gorovsky.Deposition and Function of Histone H3 Variants in Tetrahymena thermophila.Molecular and Cellular Biology.2006，26(20)：7719-7730.)。尽管该方法可以获得遗传稳定的细胞株，即小核(生殖核，传递遗传信息)和大核(体核，执行转录功能)中的内源基因均被改造，但该方法的转染技术复杂、耗时长且成功率低，具体应用到四膜虫的多基因定向修饰方面难度较大。首先，转染效率低。小核基因改造纯合细胞株是通过基因枪法转染接合生殖过程减数分裂crescent期小核来完成的，该方法需要精确配比不同交配型的四膜虫细胞，并提供稳定的环境条件，如温度、湿度等，以确保几乎完全同步的接合配对。并须严格把握转染时机，即在90％以上配对细胞均进入crescent期时进行转染，尽管如此，也无法保证成功转染。其次，筛选过程繁琐。除须进行巴龙霉素和杀稻瘟菌素抗性筛选外，还需经过3轮与不同缺陷型细胞株的配对，并进行6-甲基嘌呤和放线菌酮抗性筛选，才可获得纯合的小核基因改造细胞株。最后，无法获得必需基因突变细胞株。接合生殖期小核转染获得的是纯合的小核、大核基因改造细胞株，即小核与大核所有染色体上的等位基因均被完全替换或引入突变。因而对于接合期有性生殖细胞核分化和发育所必需的基因，核发育将终止，配对细胞则分开并降解；对于营养生殖期细胞生长所必需的基因，配对细胞在核发育完成后形成的后代细胞，由于大核中必需基因缺失导致的致死性表型，将无法存活。

如何能进一步提高四膜虫多基因转染成功率、简化操作步骤，并获得必需基因突变细胞株是应用多基因定向修饰实现四膜虫基因联合应用研究所面临的重大课题。大核分步转染不同基因打靶载体获得大核多基因改造细胞株被认为是解决该问题的有效途径之一。本发明通过大核分步转染及巴龙霉素和杀稻瘟菌素分步配合筛选，先后获得大核A基因改造细胞株及大核A、B基因改造细胞株。本发明与现有技术相比转染效率高、操作简单，且可用于研究必需基因缺失或突变对相关基因表达及功能的影响，是四膜虫基因联合应用研究的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提高四膜虫多基因转染成功率、简化操作步骤，并获得必需基因突变或缺失细胞株从而进一步研究必需基因缺失或突变对相关基因表达及功能发挥的影响。为实现上述目的，本发明通过pNeo4及pBsr分别介导的基因打靶，及两种抗生素配合筛选，可快速、有效实现两不同目的基因转染四膜虫细胞株的构建，具体技术方案包括：

本发明中基因打靶载体pNeo4序列包含载体骨架、可插入靶基因同源序列的多克隆位点及含巴龙霉素(Paromomycin)抗性基因的Neo4基因盒，通过同源重组使得抗性基因序列Neo4基因盒替代靶基因。本发明中基因打靶载体pBsr源自载体pNeo4，将原有载体中含巴龙霉素抗性标记的Neo4基因盒替换为Bsr基因盒。Bsr基因盒源自载体pMNBL，是由四膜虫组蛋白H4基因启动子序列、杀稻瘟菌素抗性基因(blasticidin S resistance gene，bsr)及BTU2基因终止子序列构成的融合序列(结构示意图见附图1A)。所述基因打靶载体pBsr的构建包括如下步骤：