[发明专利]一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法，其特征在于具体构建步骤包括：

(1)将靶基因A的5′和3′同源序列通过酶切、连接的方法，分别克隆到含巴龙霉素抗性标记的打靶载体pNeo4中，经基因枪法转化营养期四膜虫，通过巴龙霉素抗性筛选及PCR单克隆鉴定，获得大核基因遗传转化的阳性细胞株a；

(2)将靶基因B的5′和3′同源序列通过酶切、连接的方法，分别克隆到含杀稻瘟菌素抗性标记的打靶载体pBsr中，经基因枪法转化营养期四膜虫细胞株a，巴龙霉素配合杀稻瘟菌素抗性筛选：巴龙霉素与杀稻瘟菌素的初始浓度均为100μg/mL，随着杀稻瘟菌素浓度倍性增加，巴龙霉素浓度始终保持200μg/mL，直至杀稻瘟菌素达到终浓度800μg/mL，PCR单克隆鉴定获得大核基因遗传转化的阳性细胞株a/b。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的打靶载体pBsr具体构建步骤包括：

(1)以四膜虫载体pMNBL为模板，上、下游引物为：5′GCGGCCGCGCATCTGGTGAGATATCTTCAAAGT-3′、5′-CTCGAGATCATGATGGAAAATAAAACCATGCA-3′，PCR扩增获得包含杀稻瘟菌素抗性基因的Bsr基因盒序列，且在其5′和3′末端分别引入限制性内切酶Not I和Xho1I识别位点；

(2)对Bsr基因盒序列及pNeo4进行Not I和Xho1I双酶切，并回收酶切产物：Bsr基因盒及pNeo4大片段；

(3)使用T4连接酶连接以上酶切片段，得到载体pBsr。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的基因枪转化法为基因枪粒子轰击营养期四膜虫大核。

4.权利要求1所述一种多基因转染嗜热四膜虫细胞株的构建方法在四膜虫必需基因RAN1敲减及AIF蛋白与HA标签蛋白融合表达中的应用。