[发明专利]一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)原料预处理

将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2～10倍的碱溶液，搅拌1～12小时，除掉鱼鳞包括脂肪和杂蛋白在内的杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2～10倍的酸溶液，搅拌1～12小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1～4％，酸溶液的质量体积浓度为3～8％，预处理温度控制在0～25℃之间；

(2)Ⅰ型胶原蛋白提取

向处理后的原料中添加0.05～10mol/L的弱酸作为提取剂，浸提温度为0～10℃，原料与提取剂的重量比为1:10，同时加入原料重量0.05％～5％的胃蛋白酶进行2～72小时的搅拌浸提，提取步骤重复0～5次，浸提液混合汇总，再进行冷冻离心过滤，所得的离心上清液为酶溶性Ⅰ型胶原蛋白粗提液，

(3)Ⅰ型胶原蛋白分离纯化

膜分离工艺技术纯化酶溶性I型胶原蛋白粗提液，粗提液用孔径为0.2～0.1μm或相对分子量为300KD～200KD的超滤膜，超滤膜流速为0.91～1.82立方米/小时，膜压力为0.1～0.4Mpa，温度为0～10℃，去除残余的胃蛋白酶、小分子杂质和无机盐，浓缩得到色谱纯度≥90％，具备三螺旋结构的高纯I型胶原蛋白溶液；

(4)Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥

冷冻干燥热敏性的I型胶原蛋白溶液，得到酶溶性高纯超螺旋结构I型胶原蛋白成品。

2.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)原料预处理所使用的鱼鳞为海洋鱼类鱼鳞或淡水鱼类鱼鳞。

3.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)原料预处理所使用的碱为碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠或氢氧化钾；酸为盐酸或硝酸。

4.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)Ⅰ型胶原蛋白提取所使用的弱酸为醋酸、柠檬酸、草酸或苹果酸。

5.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中所使用的离心机为8000～15000rpm的大型高速冷冻离心机。

6.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)分离纯化使用孔径为0.2～0.1μm或相对分子量为300KD～200KD的超滤膜时，流速为1.20～1.50立方米/小时，膜压力为0.2～0.3Mpa，温度为0～10℃。

7.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中离心过滤和步骤(3)分离纯化的温度为0～10℃。

8.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中所使用的冷冻干燥的隔板温度为-10～-20℃、真空度为13.33Pa、冻干时间为12～36小时。

9.根据权利要求1所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述的酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白为低抗原性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白；通过HPLC检测，纯度≥90％，通过MALDI-TOF-MS检测，质谱图无杂峰，分子量为288kDa，具备三螺旋结构的高纯I型胶原蛋白。

10.根据权利要求1～9任一项所述酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法，其特征在于：所述步骤1)原料预处理之前，先对鱼鳞进行清洗以除去颗粒杂质。