[发明专利]一种大肠杆菌突变株及利用该菌生产手性天冬氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术和发酵工程领域，具体的说，涉及一种大肠杆菌突变株及利用该菌株进行废水回用工艺生产手性天冬氨酸的方法。

背景技术

天冬氨酸(Aspartic acid)又称氨基丁二酸,是构成机体蛋白质的主要氨基酸之一。结构式为:HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH,分子量133.10。它有两种旋光异构体:D型和L型。通常所说的天冬氨酸是指等量的D型和L型的混合物,为无色单斜棱柱形结晶,溶于水,微溶于75％(质量分数)乙醇,不溶于乙醚。

天冬氨酸为酸性氨基酸之一，属非必需氨基酸，在体内由谷氨酸转氨给草酰乙酸而得，分解则通过脱氨基生产草酰乙酸或经天冬氨酸酶的作用脱氨生成丁烯二酸进入三羧酸循环。它是生物体内赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸以及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体。它可作为钾离子、镁离子的载体向心肌输送电解质，从而改善心肌收缩功能，同时降低氧消耗，在冠状动脉循环障碍缺氧时，对心肌有保护作用。它参与鸟氨酸循环，促使氨和二氧化碳生成尿素。降低血液中氨和二氧化碳的含量，增强肝脏功能，消除疲劳。

目前天冬氨酸的合成主要有化学法和酶法合成两种。化学法主要用于生产天冬氨酸的外消旋体DL-天冬氨酸。近年来，波兰、日本、德国用经顺丁烯二酸酐(马来酸酐)和氨化剂直接进行加成反应合成出天冬氨酸。这种方法具有原料易得、过程简单、反应条件温和及产物易分离等特点，适合于大规模生产。

波兰的Machowski S等人用顺丁烯二酸酐和过量氨水与NH4Cl反应，反应在一间歇反应釜中，于140℃、0.4MPa下反应2.5h。将得到的混合物冷却至70℃后用盐酸酸化至pH2.5，再冷却至室温，此时天冬氨酸沉淀析出，将沉淀过滤，4℃下水洗后得到产品，产率为55％。

2002年，浙江大学的邢亚军等在一钛材高压釜中，对顺丁烯二酸酐)进行氨化反应合成了DL-天冬氨酸。通过实验研究对原有合成工艺作出了改进，使产品收率提高到70％以上，并且对产品的分离提纯采用顺丁烯二酸(马来酸)代替盐酸进行酸化结晶从而提高了反应物的利用和减少反应剩余物的污染。

2003年天津大学的王亚权等提出了一种简便的、不使用任何催化剂的化学合成法。实验在聚四氟衬里的250ml高压釜中进行。实验步骤如下：将32.5g顺丁烯二酸酐(分析纯)溶于70ml水中，加入氨水(分析纯)至pH8，充1MPa氮气，然后在电磁搅拌下加热至453K，反应6h，反应后冷却至室温，过滤后得无色晶体，收率63.1％，熔点338℃。产物的红外光谱与DL-天冬氨酸的标准谱图吻合，容量分析表明天冬氨酸含量≥98％。

而酶法合成是目前工业上合成天冬氨酸左旋单体的主要方法，这种方法不仅收率高而且光学纯度高。酶法是用天冬氨酸酶催化氨与富马酸发生加成反应而得，其反应式如下所示：

生物酶法又可分为IC法和FWC法。IC法是固定化细胞法或固定化酶法工艺，即将天冬氨酸酶制备为固定化酶或将具有天冬氨酸酶活力的大肠杆菌制备为固定化细胞，通过酶促反应促使由富马酸转化为L-天冬氨酸的工业化生产。而与固定化细胞法生产L-天冬氨酸相比，游离整体细胞法具有较高的工作活力和生产能力，工艺流程更为简洁，需要的设备投资较少，因而生产成本更低，具有较强的市场竞争力。游离整体细胞法生产L-天冬氨酸的主要流程为：以顺丁烯二酸为原料，在溴化钠与过硫酸氨的催化作用下生成反丁烯二酸，加氨后在大肠杆菌生物反应器内以大肠杆菌培养液为酶源，经过酶促反应生成L-天冬氨酸，最后经过盐酸调节等电点回收，废液则排出进行无害化处理。如果工艺进行改良，用反丁烯二酸代替盐酸进行等电点调节，回收天冬氨酸后将废液回用，补加反丁烯二酸和催化剂后再进行新一轮生产，则废水排放量将大大减少。工艺改良的关键是选育耐受回用废液积累的溴化钠等盐分的大肠杆菌。

在目前天冬氨酸生产工艺中，现有工程菌株对盐分的耐受程度不佳，反应体系中溴化钠与过硫酸氨的累积会对酶促反应有抑制作用，因此无法将废液回用，造成废液排放量大，污染严重的问题。

本发明定位于天冬氨酸生产的工艺改进，利用微生物技术针对性地选育耐盐大肠杆菌，并对获得的菌株进行了分析和应用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种耐盐大肠杆菌突变株，可用于废水回用工艺生产天冬氨酸。