[发明专利]一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，特别涉及一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法。

背景技术

番茄红素是一种长链不饱和碳氢化合物，是自然界中抗氧化性最强的类胡萝卜素。番茄红素广泛存在于红色的水果蔬菜中，具有抗氧化、抗癌、降血脂、提高免疫力等功能，在新型保健食品、化妆品和药品中都具有广阔的应用前景，是一种很有发展前途的新型功能性天然色素。

番茄红素生产方法主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法三种。从生产原料和成本、工艺以及产品活性和纯度等方面综合考虑，微生物发酵法具有明显的优势，是番茄红素理想的产业化生产方法。特别是随着转基因技术的迅速发展，利用基因工程菌生产番茄红素已成为研究的热点。

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，它控制着基因转录的开关、增强或减弱。其中，全局转录因子处于整个转录调控网络的顶端，是一类可以调节不同代谢途径中大量基因的转录因子。大肠杆菌中共有七个全局转录因子，它们能直接调控菌体内超过50%基因的转录。不仅如此，全局转录因子还能通过调控其它的转录因子，来间接控制被调控因子所负责的基因的转录表达。CRP（碳代谢总体调控蛋白）是大肠杆菌的一个重要的全局转录因子，研究表明大肠杆菌中超过95%的基因都能被CRP所直接或间接的调控。因此，可通过调控CRP这个全局转录因子，优化大肠杆菌中番茄红素合成的整体代谢网络，提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤：

1. 制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组（λ-red）转入大肠杆菌（BW25113），得到产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE；

2. 将大肠杆菌菌株中的野生型crp基因克隆到pKSC质粒上，得到重组载体pKSC-crp； crp的基因序列如SEQ ID NO.1所示；crp的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示； pKSC质粒的基因序列如SEQ ID NO.3所示；重组载体pKSC-crp的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

3. 碱基替换：将步骤（2）得到的重组载体pKSC-crp上的crp基因进行碱基替换：A26T，得到优化的重组载体pKSC-crp1；pKSC-crp1的基因序列如SEQ ID NO.11所示；

4. 用pKSC-crp1中的crp1基因替换步骤（1）得到的产番茄红素的大肠杆菌菌株BW25113-BIE中的野生型crp基因，得到番茄红素高产量的菌株BW25113-BIE crp::crp1；crp1的基因序列如SEQ ID NO.5所示；

本发明的有益效果是：通过对大肠杆菌菌株中的野生型crp基因的碱基替换A26T，影响其所调控的各种基因的转录水平，主要调控了代谢合成相关基因、膜合成相关基因、转运相关基因、氧化还原相关基因和其它一些转录因子，从而优化番茄红素合成直至整个菌体的代谢网络，进而提高番茄红素在大肠杆菌中的合成能力，对利用大肠杆菌工业化生产番茄红素具有重要的意义。

附图说明

图1：重组载体pKSC-crp结构示意图；

图2：本发明菌株BW25113-BIE crp::crp1生产番茄红素结果图。

具体实施方式

该野生型crp的DNA序列及氨基酸序列分别在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中给出。

本发明的转化细胞可以使用大肠杆菌细胞。上述转化细胞可以通过电穿孔法、氯化钙法等公知的方法将重组载体导入细胞进行制备。作为重组载体及转化细胞的具体例中，可以举出下列实施例中给出的重组载体pKSC-crp和用此载体得到的转化大肠杆菌BW25113/pKSC-crp。

番茄红素在大肠杆菌中是在胞内积累的，这使得产番茄红素的大肠杆菌在平板上呈现红色。

基于以上原理，本发明一种提高大肠杆菌发酵生产番茄红素产量的方法，包括以下步骤：

1. 制备产番茄红素的大肠杆菌菌株：crtE、crtB、crtI是合成番茄红素所需的酶，将这三种酶的基因通过同源重组（λ-red）转入大肠杆菌（BW25113），得到产番茄红素的大肠杆菌菌株（BW25113-BIE）；