[发明专利]一种利用miRNA5794基因预测水稻白叶枯病的方法

权利要求书

1.一种利用miRNA5794基因预测水稻白叶枯病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

选取9311水稻品种作为待测水稻和对照水稻；

栽培所述待测水稻和所述对照水稻；

分别分离所述待测水稻和所述对照水稻中的总miRNA基因；

分别检测所述待测水稻和所述对照水稻中的所述总miRNA基因中的miRNA5794基因的表达量，所述miRNA5794基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

根据所述待测水稻和所述对照水稻中的miRNA5794基因的表达量，判定实验是否成功，若成功，则进一步判断所述待测植株是否感染白叶枯病。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述栽培所述待测水稻和所述对照水稻时，所述对照水稻在栽培时采用保护性栽培措施并防治白叶枯病，除所述保护性栽培措施和防治白叶枯病外，所述对照水稻与所述待测水稻的栽培条件保持一致。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述保护性栽培措施包括土壤隔离、水源隔离和空间隔离。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在上午8：55～9：05利用所述待测水稻和所述对照水稻的相同叶片的相同部位进行所述总miRNA基因的分离。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA5794基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时定量PCR方法的前处理步骤包括：

利用分光光度计测定并获得分离的所述总miRNA基因的浓度；

向所述总miRNA基因中加入外源参考miRNA基因，得到第一混合液，所述外源参考miRNA基因的加入量为所述总miRNA基因质量的0.05％，所述外源参考miRNA基因的序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

分别将所述总miRNA基因和所述外源参考miRNA基因的5’端与3’端连接，得到环化的所述总miRNA基因和环化的所述外源参考miRNA基因的混合液；

将所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液进行逆转录，得到的逆转录产物用于进行所述实时定量PCR检测。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用实时定量PCR方法，检测所述miRNA5794基因在所述待测水稻和所述对照水稻中的表达量，包括：

将2μl所述逆转录产物、3μl浓度为1μM的引物、10μl定量PCR混合物和0.4μl50倍的ROX荧光校正染料混合均匀，得到第二混合液，将所述第二混合液在实时定量PCR仪中进行反应，所述反应程序为：50℃2分钟；95℃10分钟；95℃45秒，56℃45秒，66℃30秒，67℃30秒，共45个循环，其中，66℃30秒和67℃30秒在每循环一次后分别增加0.1℃和0.2℃，在每一次循环的最后一步收集荧光信号，所述荧光信号的强弱用于衡量所述表达量的多少；

所述引物包括：序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的miRNA5794基因正向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:4所示的miRNA5794基因反向引物、序列如序列表中SEQ ID NO:5所示的外源参考miRNA基因正向引物、以及序列如序列表中SEQ ID NO:6所示的外源参考miRNA基因反向引物。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述环化的总miRNA基因和所述环化的外源参考miRNA基因的混合液进行逆转录的步骤包括：

取所述环化的总miRNA基因和环化的外源参考miRNA基因的混合液2μl、5μl浓度为1μM的逆转录引物、2μl浓度为10mM的dNTP、5μl浓度为100mM的DTT和20U的逆转录酶，用水补足50μl混匀后，得到第四混合液，将所述第四混合液于42℃保温2小时，75℃保温15分钟，使酶失活，得到所述逆转录产物；所述逆转录引物包括miRNA5794基因的逆转录引物和外源参考miRNA基因的逆转录引物，所述miRNA5794基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述外源参考miRNA基因的逆转录引物序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。