[发明专利]基于DNA Barcoding的鲶鱼及其生肉制品的鉴别方法及鉴别试剂盒

说明书

技术领域

本发明公开了一种鱼类的鉴别方法，尤其涉及到一种基于DNA Barcoding的鲶鱼鉴别方法。 

背景技术

鱼类作为水生环境的指标生物，不仅可做为水体净化指标，还可以作为外来物种入侵检验指标，同时鱼类多样性指标也可以反映其生境状态。近年来，随着我国经济的高速发展，生态问题日益突出，为外来物种的入侵提供了便利条件，给当地鱼类开发和保护带来隐忧。如何快速有效的识别鱼类成为迫切需要解决的问题。但是，由于传统的形态分类学目前得不到足够的重视，形态分类的专业人员逐步减少，影响了鱼类资源保护以及生境研究等工作。 

近年来广泛发展的一种由四川大学研发出的鱼类分子生物学快速鉴别方法CN200510022323.1，是通过编码鱼类RNA的核DNA序列的保守性及其转录间隔子的种间差异结合传统的电泳技术鉴别鱼类，这种方法耗时较长，成本较高，更关键的是这种方法无法用于筛选和鉴定特定的鱼类。 

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种鲶鱼及其生肉制品的鉴别方法，通过对编辑好的碱基序列长度进行比较来鉴别多种鱼类中是否有鲶鱼，该方法是基于DNA Barcoding建立的，不受被鉴定材料的形态限制，即便是个体的组织碎片，也能得出准确的结论，因此可广泛用于鲶鱼及其生肉制品的准确鉴定。 

具体的说，本发明是通过下述技术方案实现的： 

基于DNA Barcoding的鲶鱼及其生肉制品的鉴别方法，包括下述步骤；1)根据已知鱼类的DNA条形码数据库，设计和合成多组引物；2)从包含鲶鱼的多种鱼类中提取DNA，利用引物对每种鱼的DNA进行扩增，根据扩增的结果，选出最佳引物和反应条件；3)利用步骤2)筛选出的引物对每个待测对象的DNA进行扩增，扩增后的序列进行测序，然后进行进行校正、比对，从而得到针对常见鱼类DNA Barcoding数据库；4)在建立DNA Barcoding数据库后，对新的待测对象采用步骤2)筛选出的引物进行检测，将其与步骤3)的DNA Barcoding数据库中的序列长度进行比对，从而确定其是否为鲶鱼。 

通过上述方法，先建立对应特定引物的准确的含有常见鱼类COI序列长度的DNA Barcoding数据库，在后续检测新的待测样品是否为鲶鱼时只需进行序列长度比对即可进行鉴定得到准确结果。 

其中，对序列进行校正、编辑的操作为将测序返回的峰图读入MEGA5软件中，用Chromas软件打开峰图，并将峰图和MEGA5中的碱基序列进行对照，根据峰图将丢失的碱基和错误的碱基进行校对更正。 

其中，在上述方法中，采用酚氯仿抽提法提取DNA。 

具体的说，通过上述方法筛选得到了两种具有良好PCR扩增性能的引物，分别为： 

引物1：F-BaL1023/F-BaH1377：CAAGTCGTAACATGGTAAG/ATCATGATGCAAAAGGTAC； 

引物2：F-BaL1475/F-BaH1752：CCCGTCTCTGTGGCAAAAGAG/TGGCTGCTTTTAGGCCCAC。 

通过上述引物，得到的DNA Barcoding数据库如下表1所示： 

表1:DNA Barcoding数据库 

在进行新的样品检测时，只需利用引物1或引物2对样品提取的DNA进行扩增后测序。然后进行序列编辑、人工校正，降序列长度与202(对应引物1)、306(对应引物2)比较，相同既为鲶鱼，否则便不是。 

为了便于上述检测，本发明公开了一种鲶鱼及其生肉制品的鉴别试剂盒，包含上述方法中选出的引物1和/或引物2，利用该试剂盒，可快速用于鲶鱼及其生肉制品的鉴别。 

具体实施方式

本发明的方法，按照下述步骤进行： 

1.首先在NCBI中登陆GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)浏览鱼类DNA条形码数据库，下载Complete genome of fish，并采用Primer Premier5.0软件设计和合成引物。 

2.然后进行鱼类DNA提取的操作，操作步骤如下： 

(1)每份样品取10mg肌肉组织，用眼科解剖剪将其尽量剪碎。 

(2)将提取的样品小心的装在1.5ml的高压灭菌离心管中，然后加600ulSET(裂解液)。