[发明专利]一种检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体地，涉及一种同时检测沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)三种菌株的方法。

背景技术

食品中存在的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌导致的食源性疾病呈逐年上升趋势，给人们的健康带来很大的潜在威胁。由沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌在全球范围内引发的食源性疾病导致大量人员死亡，造成数十亿美元损失。一份2003-2007年中国细菌性食源性疾病流行病学特征分析显示，由微生物引起的食源性疾病事件中，沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的比例分别为10.3％、8.9％和1.5％，三种致病菌导致的食源性疾病事件总数占到统计的1060起食源性疾病时间的20％以上。

目前应对食品安全突发事件的手段一般为采集样品后送到相关检测机构进行传统分离培养，经生理生化实验后进行确认或排除。此方法培养时间长、工作量大、实验步骤繁琐，在很多突发事件中不能及时反映准确的数据。常规PCR方法检测时间短，但其灵敏度和可能带来的污染是不能不考虑的问题。免疫磁分离技术是将特异性抗体与一定大小的磁珠偶联，利用特异性抗体能与细胞表面抗原相结合的原理，将磁球与细胞结合，在外磁场的作用下，将磁球-细胞复合物从环境中分离出来，达到获取目标细胞的一项技术，但是单独使用该技术时只能实现分离，还需结合其他手段进行检测，而目前使用免疫磁分离技术进行分离的检测方法的灵敏度仍有待提高。Taqman探针法多重实时荧光定量PCR技术采用了封闭式反应体系，采用多组特异性引物及探针，针对多组目标菌进行同时扩增检测，而其准确性仍有待提高。

目前应用免疫磁分离-多重荧光定量PCR对食品中的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行三重检测还未见有报道，值得进一步研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有检测方法灵敏度和准确性不高以及难以实现三种菌株的同时检测的缺陷，提供一种具有高灵敏度和准确性并能够同时检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法。

为了实现上述目的，本发明的发明人进行了大量的研究，发现食品中的复杂成分、培养基成分以及DNA提取过程中提取液的残留成分等都是PCR反应的潜在抑制因子，会直接影响检测结果的准确性。进一步研究后发现，配合使用免疫磁分离技术与多重荧光定量PCR的方法能够有效地实现沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的同时检测。因此，本发明提供了一种检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将待测样品与液体培养基混合，并将混合物置于能够使待测样品中可能存在的细菌扩增的条件下进行培养，获得扩增后的样品；

(2)利用免疫磁珠捕获扩增后的样品中可能存在的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌，所述免疫磁珠由抗体与磁球偶联得到；

(3)提取步骤(1)中捕获的菌体的基因组DNA；

(4)采用针对沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的特异性引物对提取到的基因组DNA进行多重荧光定量PCR，根据多重荧光定量PCR的结果确定待测样品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的存在。

通过上述技术方案，本发明实现了沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的同时检测，灵敏度高且结果准确。而且，本发明方法能够快捷地对待测样品中的沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌进行检测，对提高快速应对食品安全突发事件的能力具有重大意义。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的单位“CFU/g”意指以每克待测样品为基准的菌株的CFU数；使用的术语“免疫磁珠”是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微球(或磁球)的表面上，形成的免疫磁性微球；术语“PCR”是指聚合酶链式反应；术语“引物”包括至少一个上游引物和至少一个下游引物；本发明中使用的液体体积均为20℃下的数值。

本发明提供了一种检测沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将待测样品与液体培养基混合，并将混合物置于能够使待测样品中可能存在的细菌扩增的条件下进行培养，获得扩增后的样品；