[发明专利]一种磷脂酶A2突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷脂酶及其制备方法。本发明涉及通过重叠PCR技术体外定向进化构建的比酶活提高的磷脂酶A₂突变体，具体的说涉及到利用分子生物学技术获得比酶活提高的磷脂酶A₂突变体，属于酶的基因工程技术领域。

背景技术

磷脂酶A₂(Phospholipase A₂，PLA₂)，是磷脂-2-酰基水解酶(EC3.1.1.4)，它催化甘油磷脂sn-2位酯键的水解反应，生成溶血磷脂和脂肪酸，在磷脂分解代谢中有重要作用，此外某些来源的磷脂酶A₂具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键碱基交换的功能。

磷脂酶A₂广泛存在于自然界，几乎所有的生物细胞及亚细胞中都有这种酶。存在于细胞内的磷脂酶A₂，浓度、酶活较低，但参与许多重要的生理代谢过程；存在于细胞外的磷脂酶A₂，含量高、活力强、易于富集纯化，是工业商品磷脂酶A₂的主要来源。

磷脂酶A₂在多个领域具有应用价值，1、用于溶血磷脂的制备：溶血磷脂在食品加工中可作为乳化分散剂、乳化剂使用，溶血磷脂添加在护肤化妆品中，能起到舒展皮肤皱纹，改善粗糙结构的作用。2、用于油脂精炼：磷脂酶A₂可以将油脂中的磷脂转化成易于溶解在水中的溶血磷脂，然后经过离心即可除去油脂中的磷脂，以达到脱胶的目的。3、用于功能性磷脂的制备：由于某些磷脂酶A₂具有催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键碱基交换的功能，可以将不饱和脂肪酸(如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸)整合在磷脂骨架中，从而提高磷脂的生理功能。

虽然磷脂酶A₂具有很多应用价值，但距工业生产的需要，特别是与其他酶生产和应用相比，存在很大的差距，主要原因是：1、酶源狭窄，目前磷脂酶A₂主要从动物胰脏、蛇毒、蜂毒中提取，也有从动物内脏或微生物中提取磷脂酶A₂，但是工艺复杂，不利于磷脂酶A₂的大量生产和利用；2、该酶的作用机理尚未完全搞清，目前对其催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键水解的研究较多，而对催化磷脂sn-2位磷酸二脂酯键碱基交换的研究甚少。

酶分子体外定向进化属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程的新策略。利用分子生物学手段在分子水平创造出分子的多样性，结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的突变体。它不需事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，而是人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，获得具有某些预期特征的改构酶。定点突变就是在已知的DNA序列中插入、缺失或取代一定长度的核苷酸序列。该方法已经被广泛的应用于基因表达的调控、基因结构与功能及蛋白质性质等方面的研究。本发明所使用的定点突变的方法是重叠PCR技术，该技术可以简单、快速的将两个或多个基因片段通过末端互补、重叠延伸进行体外基因的拼接。重叠PCR技术可以获得依靠限制性内切酶消化难以得到的产物，并且方便快速，在进行大片段基因的定点突变、基因片段删除以及多个编码序列嵌合连接上具有独有的优势。

枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌。枯草芽孢杆菌表达系统有以下优点：1、能够高效地分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽孢杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽孢杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并具有生长迅速，对营养无特殊要求的优点；4密码子偏爱性不明显；5发酵简单，枯草芽孢杆菌是好氧菌，无需厌氧发酵设备，对培养基无特殊要求，发酵结束后，简单地分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的纯化回收阶段；6具有抗逆性，可生产多种耐热性酶制剂。