[发明专利]一种微生物发酵产苯丙氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种发酵制备L-苯丙氨酸的新方法，具体是对发酵生产L-苯丙氨酸的过程，进行了氮源的优化以及多阶段指数L-酪氨酸补料策略的提出。

背景技术

L-苯丙氨酸，又称L-苯基丙氨酸，是人体必需的但无法自行合成的八种必需氨基酸之一，广泛应用于医疗药品、化妆品、食品及其添加剂领域，特别的，作为合成甜味剂阿斯巴甜的原料之一。L-苯丙氨酸的传统生产方法是化学合成法和酶法，但是化学合成法具有环境污染、产物大多是消旋体，后续加工工艺复杂；酶法具有原料昂贵等缺点。考虑到环境和生产成本问题，最经济的同样也是被人们广泛使用的是微生物发酵法。

L-苯丙氨酸的生产菌株，大多数是L-酪氨酸营养缺陷型的。发酵过程中过量添加L-酪氨酸，则会造成细胞的大量生长，从而使得更少的碳流流向L-苯丙氨酸的合成；添加的L-酪氨酸过少，则会引起细胞生长缓慢甚至过少，从而没有足够的菌体产生更多的L-苯丙氨酸。目前，L-酪氨酸补料有进行恒定速度流加，有根据L-酪氨酸消耗速率流加，有根据发酵过程的OUR的相关公式流加，也有L-酪氨酸指数补料的。中国专利CN102212569A公开了一种提高L-苯丙氨酸生产强度的L-酪氨酸流加的方法。在初始培养基中L-酪氨酸消耗完毕后，其以25mg/h-100mg/h恒速流加至发酵结束。由此，本发明提出了多阶段指数流加L-酪氨酸的策略，从而达到提高L-苯丙氨酸，降低生物制备L-苯丙氨酸的生产成本，提高经济效益的目的。

另外，发酵过程的氮源，不仅维持细胞的正常生长，而且在产L-苯丙氨酸的过程中起着重要的作用。由此，微生物发酵产L-苯丙氨酸过程中，进行氮源的优化，包括硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵生产L-苯丙氨酸的方法，以达到产量提高，以及原料的减少。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生产L-苯丙氨酸的发酵方法，包括菌种活化、种子培养、发酵培养，其特征在于，还包括多阶段指数L-酪氨酸补料策略。

进一步的，所述的方法还包括发酵培养基中氮源的优化。

进一步的，所述的发酵的菌株为大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)。

进一步的，所述的多阶段指数L-酪氨酸补料策略具体步骤如下：发酵12h后开始补加L-酪氨酸；12-32h维持菌体比生长速率在0.08h^-1；32-52h，维持菌体比生长速率为0.05h^-1；52-72h,维持菌体比生长速率为0.02h^-1。

进一步的，初始L-酪氨酸浓度为0-2.4g/L，优选的为0.3-1g/L。

进一步的，所述的氮源优化包括对发酵培养基中硫酸铵浓度和有机氮源种类的优化。

进一步的，所述的硫酸铵的浓度为0-30g/L，优选的在5g/L以下。

进一步的，所述的有机氮氮源的优化为单一有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉10g/L、玉米浆干粉11.5g/L、棉籽饼粉10g/L、豆饼浸粉7.9g/L、蛋白胨9.2g/L。

进一步的，所述的有机氮氮源的优化为复合有机氮源优化，其种类及其浓度为酵母粉5g/L和玉米浆干粉5.75g/L，蛋白胨4.6g/L和玉米浆干粉5.75g/L，酵母粉5g/L和蛋白胨4.6g/L，优选的，为酵母粉和玉米浆干粉复合有机氮源。

进一步的，所述有机氮源的总氮量是相当，并且复合有机氮源中两个单一有机氮源是按其含氮量1:1添加

本发明的有益效果在于：

本发明通过对氮源的优化设计，减少硫酸铵用量和利用一些廉价的有机氮源替代一些昂贵的有机氮源，同时通过多阶段指数L-酪氨酸补料策略的提出减少了L-酪氨酸的流加量，从而达到提高L-苯丙氨酸产量，降低生物制备L-苯丙氨酸的生产成本，提高经济效益，有利于L-苯丙氨酸生物法的工业制备。

附图说明

图1为不同浓度的硫酸铵条件下大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)发酵制备L-苯丙氨酸的趋势图图2为不同种类的有机氮源条件下大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)发酵制备L-苯丙氨酸的趋势图(注：YE酵母粉，CSP玉米浆干粉，CP棉籽饼粉，SP豆饼浸粉，T蛋白胨，CSPYE酵母粉和玉米浆干粉，CSPT蛋白胨和玉米浆干粉，YET酵母粉和蛋白胨)。

图3为不同初始酪氨酸条件下，大肠杆菌BL21(pET/P-aspC)的不同比生长速率对应的比合成L-苯丙氨酸的合成速率的趋势图