[发明专利]一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，检测样品中少量的非结核分枝杆菌。

背景技术

根据中国卫生部组织的第四次全国结核病流行病抽样调查(2000年)得出的结果，我国有4亿人感染过结核菌，现有的传染性结核病人达200万人，结核病的人数位居世界第二，仅次于印度。中国卫生部2006年3月公布的全国传染病疫情报告中指出，肺结核仍然占甲、乙类传染病种中发病数和死亡数的首位。大部分的结核病人或生活在结核病高发地区的居民，都很难得到迅速、准确的诊断。虽然非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacterium species,NTM)的特性有别于结核分枝杆菌，但常常会引起结核样病变，并且对常用的抗结核菌药物耐受。临床上经常将非结核分枝杆菌感染误诊为结核杆菌感染，这不仅会影响患者的诊断与治疗，也会导致结核疫情资料的错误。因此在结核病诊断中，快速鉴定或区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染对于病人的治疗、医院的传染病防治都至关重要。

目前临床上检测结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌最常用的方法是抗酸染色镜检法，该方法具有简单、快速、成本低的优点，缺点是灵敏度低，痰内或者其它标本内含菌量少时往往不能得出阳性结果，并且不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌。

分子信标探针(Molecular beacon probe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和靶序列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本发明通过对大量结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌菌株的16S rRNA序列进行比对，挑选非结核分枝杆菌的特异性序列，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了非结核分枝杆菌当前临床检测的诸多问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中非结核分枝杆菌的方法。

一种快速检测非结核分枝杆菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon NTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

所述探针的5’端用Cy3标记，3’端用BHQ1标记，荧光基团激发波长552nm，检测波长570nm。

进一步地，所述分子信标浓度为10ng/μL。

本发明还提供了一种快速检测非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)裂解液：4％(w/v)氢氧化钠；

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl(pH7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon NTM：5’-CY3-CATTGTACGCCCAGTAATTCCGGACCAATG–BHQ1-3’；

(3)终止液：1％(v/v)稀硫酸；

(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。

本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测非结核分枝杆菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，自然风干；

(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；

(3)52℃杂交10分钟；

(4)液侵泡1分钟，终止反应；

(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。