[发明专利]一种空肠弯曲杆菌感染相关鸡microRNA的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种空肠弯曲杆菌感染相关鸡microRNA的鉴定方法。

背景技术

空肠弯曲杆菌，一种重要的食源性病原菌，引起畜禽发病，引发人类急性肠炎，给人类带来了严重的经济损失和食品安全问题，盲肠是其主要繁殖部位。宿主的遗传背景在鸡抵御空肠弯曲杆菌中起重要作用，不同品系(品种)的鸡对空肠弯曲杆菌的易感性/抗性有显著差异。

microRNA(miRNA)是一类长度约22nt的内源性非编码小RNA，通过与靶基因3’UTR结合抑制靶基因的翻译或对靶基因进行切割，在免疫和疾病等很多生物学过程中发挥重要作用，包括细菌、病毒感染。

近几年，Solexa高通量测序技术成为各物种microRNA分析鉴定的有力工具，并且与细菌、病毒感染相关的鸡microRNA已有研究，目前尚无通过Solexa测序技术分析鉴定与空肠弯曲杆菌感染相关的microRNA的研究。这是首次大规模的分析鉴定与鸡空肠弯曲杆菌感染相关的microRNA，这将为我们深入研究microRNA在空肠弯曲杆菌中的作用机制奠定基础，为鸡的分子抗病育种提供理论基础和科学依据。

目前还没有针对空肠弯曲杆菌感染相关microRNA鉴定的研究，不存在鉴定空肠弯曲杆菌感染相关microRNA的研究。

发明内容

本发明的目的在于设计一种新型的空肠弯曲杆菌感染相关鸡microRNA的鉴定方法，解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种空肠弯曲杆菌感染相关鸡microRNA的鉴定方法，包括步骤如下：

第一步，采集1日龄鸡胎粪，通过特定培养基检测空肠弯曲杆菌阳性率；

第二步，对空肠弯曲杆菌阴性鸡只接种约10⁸cfu(菌类形成单位)空肠弯曲杆菌，对照组接种等量PBS，在接种后大于等于4个时间点采集盲肠内容物用于空肠弯曲杆菌计数、采集盲肠组织样品用于RNA提取；

第三步，根据空肠弯曲杆菌感染后的阳性率与动态变化结果，选择鸡对空肠弯曲杆菌感染敏感的时间点，采集鸡盲肠组织为实验材料；采用mirVana^TM miRNA提取试剂盒提取样品总RNA，抽提所得总RNA经安捷伦生物分析仪2100进行质检；处理组和对照组组内分别进行混池，每个组内均有2-3个混池；

第四步，按照“TruSeq小RNA样品准备指南”对纯化后的总RNA进行3′端接头连接、5′端接头连接、反转录、扩增和cDNA纯化步骤，构建测序样本文库，其中处理组≥2，对照组≥2，并对所述测序样本文库进行质检；

第五步，对纯化后的所述测序样本文库进行Solexa测序；

第六步，进行后续分析，包括小RNA测序产出的总读数分布情况，比对数据库信息、小RNA比对数据库信息、以及小RNA的长度分布统计；

第七步，利用生物信息学方法分析鉴定感染与非感染鸡盲肠组织中的差异表达的microRNA，预测其靶基因，并对靶基因的功能分类及所参与的信号通路进行分析；

第八步，综合第六步与第七步中microRNA表达的差异显著性、靶基因相关的显著富集的基因本体论术语与信号通路结果，得出与空肠弯曲杆菌感染相关的microRNAs。

根据空肠弯曲杆菌感染鸡后大于等于4个不同时间点盲肠中的细菌含量，确定鸡对空肠弯曲杆菌感染反应敏感的1个时间点；

利用Solexa方法对处理组和对照组中大于等于4个个体进行混池测序，每个组内的混池≥2；

根据microRNA本身及其靶基因的特性鉴定空肠弯曲杆菌感染相关的microRNA。

本发明涉及一种空肠弯曲杆菌感染相关鸡microRNA的鉴定方法，包括步骤如下：

第一步，采集1日龄鸡胎粪，通过特定培养基检测空肠弯曲杆菌阳性率；

第二步，对空肠弯曲杆菌阴性鸡只接种约10⁸cfu空肠弯曲杆菌，对照组接种等量PBS，在接种后大于等于4个时间点，采集盲肠内容物用于空肠弯曲杆菌计数，采集盲肠组织样品用于RNA提取；