[发明专利]一种静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，属于血液制品领域。

背景技术

乙型肝炎免疫球蛋白（HBIG）是由乙型肝炎疫苗免疫健康献浆员后采集的乙型肝炎表面抗体效价较高的血浆，经分离、提纯、病毒灭活而制备的特异性免疫球蛋白，具有特异性被动免疫作用，能够中和体内的乙肝表面抗原，并将病毒清除。早在20世纪70年代，法国就用HevacB巴斯德疫苗对志愿献血者进行免疫，获得制备HBIG所需的免疫血浆。除法国之外，美国和其他欧洲国家也相继开发出HBIG，并在人体中得到广泛应用。我国从上个世纪80年代后期开始研制HBIG，于90年代开发出该项血液制品，经临床验证效果良好，未发现不良反应。

目前乙型肝炎免疫球蛋白在阻断乙型肝炎围产期传播、预防输血后乙型肝炎病毒感染、HBsAg阳性病人肝移植后的被动免疫预防、治疗慢性乙肝病毒携带者、预防意外感染事故等方面均取得了非常好的临床验证。目前市场上主要是肌肉注射乙型肝炎人免疫球蛋白， 但是肌肉注射乙型肝炎人免疫球蛋白由于其纯度低、蛋白浓度高不能用于静脉注射，因而不能应用于大剂量的治疗因乙肝病毒引起肝硬化的肝脏移植术中。

静脉注射乙型肝炎人免疫球蛋白解决了肌注存在的不足，能够实现大剂量的给药，提高了乙型肝炎的治愈率。目前的静脉注射乙型肝炎人免疫球蛋白的生产厂家都采用低温乙醇分离蛋白的方法，通过改变溶液pH、温度及乙醇浓度进行蛋白分离提纯，但是这种方法会对乙型肝炎表面抗体效价带来影响，而且当制品中IgA和IgM过高时会影响制品的疗效，比如IgA含量对缺乏IgA的患者是首要的不安全因素，可能会引起速发型类过敏反应，因此在制备过程中有必要降低该类成分的含量。

由于该制品是通过静脉注射方式来进行的，因此药物的病毒安全性需要更多的关注。选择一种合适的病毒灭活方式对于保证患者的用药安全尤为重要。

发明内容

本发明主要针对上述问题提供一种静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺。

本发明一种静脉注射用乙型肝炎人免疫球蛋白的制备工艺，其制备工艺包括以下方面：

1、血浆融化：将乙型肝炎表面抗体效价≥8IU/ml的原料血浆于0~4℃融化；

2、组分分离：将步骤1中血浆用质量百分含量为0.85%的氯化钠溶液稀释血浆至蛋白质含量为4.5%~5.5%，调节pH值至7.0，加入95%乙醇至反应液乙醇浓度为25%，控制反应液温度在-2~-3℃，压滤，得到组分Ⅰ沉淀；

3、辛酸沉淀：将步骤2中组分Ⅰ沉淀用2倍量的0.06M醋酸盐缓冲液溶解，再用1mol/L醋酸调节pH至4.8，缓慢加入辛酸或辛酸盐沉淀，过滤收集滤液；

4、第一步层析：将步骤3中滤液用磷酸盐缓冲液调节为pH6.2，加入DEAE-Spherodex纯化，得流穿液；

5、沉淀：将步骤4中得到的流穿液电导率调节为1200us/cm，pH为6.0~6.5，压滤，收集压滤液；

6、S/D灭活：将步骤5中得到的压滤液加入10%S/D溶液搅拌，得到混合液，将混合液移入灭活罐，搅拌升温至24~26℃，放置24小时；

7、第二步层析：将步骤6中得到的混合液加入用平衡液预平衡好的DEAE-Sephadex A-50凝胶柱，吸附1小时以上，收集凝胶，然后用洗脱液洗脱凝胶5次，收集洗脱后的蛋白洗脱液；

8、成品配制：将步骤7中的蛋白洗脱液过滤、澄清、超滤、透析，用1mol/L盐酸调节pH3.8~4.4，乙型肝炎表面抗体效价≥100IU/ml，加麦芽糖使麦芽糖含量为10±1%，过滤除菌，分装。

其中步骤7的具体工艺为：①预处理：DEAE-Sephadex A-50凝胶柱用0.5mol/L NaOH浸泡2小时，然后用注射用水冲洗至中性；②平衡：将平衡液加入凝胶柱中，平衡液为0.15mol/L的NaCl；③洗脱：通过将洗脱液加入凝胶中来洗脱凝胶上吸附的蛋白，洗脱液为0.50 mol/L的NaCl。

其中制备的乙型肝炎人免疫球蛋白的规格为500IU/瓶、2000IU/瓶、2500IU/瓶、5000IU/瓶。

在步骤2中，通过提高溶液中乙醇的浓度达到完全沉淀目标蛋白的目的。

在步骤3中，通过调节辛酸浓度不但能够达到沉淀杂蛋白的目的，而且还能灭活病毒并保持IgG单体的天然状态。

在步骤4中，通过采用DEAE-Spherodex纯化，进一步达到去除杂蛋白的目的。

在步骤5中，通过调节电导率和pH去除溶液中过量的IgA和IgM。