[发明专利]检测5-HTTLPR片段多态性的方法和引物

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测5-HTTLPR片段多态性的方法和引物。

背景技术

强迫症是一种异质性高、病因复杂的精神障碍，国内外对其病因学的研究至今仍无定论，不少学者致力于遗传学、精神应激与环境、神经内分泌以及突触可塑性方面的研究，其中遗传因素起到了重要作用。

关于强迫症遗传学方面的研究结果也不尽相同，其中研究最多的就是5-HTTLPR片段多态性与强迫症的相关性。5-HTTLPR是5-羟色胺转运体基因连锁多态性区域(serotonin transporter gene-linked polymorphic region)的简称。5-HTTLPR片段的多态性是5-羟色胺转运体(serotonin transporter,5-HTT)基因的常见多态性之一。5-HTTLPR位于5-HTT基因转录起始点上游大约1kb处的启动子区，为富含GC的20～30bp重复元件的重复序列。5-HTTLPR片段存在44bp片段插入缺失多态性，影响着5-HTT基因的转录活性。5-HTTLPR片段的多态性产生长片段(L)等位基因和短片段(S)等位基因。L等位基因的转录活性比S等位基因高2.5倍。5-HTTLPR可能通过影响5-HTT基因的转录活性和5-HTT蛋白的功能而影响5-羟色胺(serotonin,5-HT)的再摄取速率，使5-HT的功能有所改变。

迄今为止，探讨5-HTTLPR片段多态性和强迫症之间关联性的研究，存在许多矛盾之处，周云飞等在汉族人群中对61例强迫症患者与68名相匹配的正常人进行研究，结果显示5-HTTLPR片段多态性的基因型与对照组差异无显著性，而L等位基因与强迫症呈正相关，使其患强迫症的危险性提高了1.929倍，是强迫症的危险因子。王振等研究认为5-HTILPR与强迫症无相关性。Ramoz等通过对352个家庭的大型队列研究，认为5-HTTLPR变异体没有参与强迫症。而Baca-Garcia等所做的研究认为5-HTTLPR的多态性中L等位基因与强迫症的发生有关，McDougle等研究也显示5-HTTLPR多态性的L等位基因与强迫症呈正相关，而与选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors,SSRIs)的疗效呈负相关。Bengel等则认为，强迫症与5-HTTLPR基因型LL呈显著性相关。另有研究结果显示强迫症患者基因型与等位基因频率与对照组均有差异，强迫症患者LL基因型与非LL基因型的比值比为1.086，说明LL基因型使强迫症的患病风险增加了1.086倍，这与Bengel等的研究一致。在强迫症患者中，LL基因型的耶鲁布朗强迫量表(Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale,YBOCS)分值明显高于LS型与SS型，说明LL基因型与强迫症的严重程度呈正相关。

许多强迫症患者常有家族史，甚至他们的父亲和/或母亲同样是强迫症患者，众所周知，家庭是社会支持系统的重要组成部分，这与许多研究结果一致。已有研究发现，父母离异是强迫症患者的危险因素，与强迫症发病呈负相关，然而寇长贵认为是否是单亲家庭与强迫症等神经症的发病无统计学关联，可能与所选对象不同有关。

由于强迫症的发病机制较复杂，遗传因素在强迫症的发病机制中占有多大比例，是否与社会环境因素相互作用等一系列问题，都需进一步研究。

目前针对5-HTTLPR多态性的检测普遍采用的是聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法和测序法。RFLP法用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。该方法简便，结果容易判定，但是也同时存在诸多弊端，①靶片段的扩增产物要纯，如在非特异性的扩增产物(特别是大片段可能含有限制性酶切位点)存在下，靶片段的扩增产物可能会发生不完全酶切或酶切后出现杂带；②酶切过程要充分(即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证)，才能避免假阴性结果产生；③酶切阳性结果可以确定所检测的具体序列，阴性结果仅可说明靶片段的扩增产物是非内切酶识别序列，但不能准确判定具体序列；④酶识别序列如有甲基化的碱基，那么将不会被内切酶切割。测序法可以比较直观的判断5-HTTLPR的多态性，但是5-HTTLPR的多态性涉及大片段碱基的缺失或插入，因而测序可能出现检测失误的可能。而本发明采用PCR扩增反应后电泳直接显带的方法，可以有效地克服PCR-RFLP法和测序法引起的缺陷，从而快速、准确、简单和低成本地检测样品。

发明内容