[发明专利]一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及生物多糖提取技术领域，特别是涉及一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺。

背景技术

国内目前有十几家透明质酸的生产厂家，且这些企业大多数是用动物组织提取法。从动物组织中提取ＨＡ常用的原料有鸡冠、脐带和猪皮等，主要工艺过程包括脱水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。这种方法的特点是工艺流程简单，适用于原料来源分散的小规模生产。但由于原料有限，且原料中ＨＡ的含量低，同时ＨＡ又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，致使其收率低、提纯难、成本过高、产品质量差，且难以应用于大规模生产。随着ＨＡ需求量的不断增大，迫切要求生产大量的高质量ＨＡ，动物组织提取法己不能适应这种要求。 国外从上世纪70年代开始研究利用发酵法生产透明质酸，采用发酵法生产的透明质酸质量稳定、原料易得，成本低。

目前微生物发酵法生产透明质酸采用的工艺发酵周期长、产物相对分子量低、产品透光率差、蛋白质含量高、葡萄糖醛酸含量低。有的透明质酸的形态为纤维状，不易溶解。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺。本发明采用复合诱变技术筛选出透明质酸产率高的菌种，结合发酵技术，透明质酸产品产出率高，可达7-9g/L。发酵得到的透明质酸易于分离纯化，生产周期短。生产易于控制，适合工业化大规模生产，收率高，并且大大降低了生产成本。

本发明的一种兽疫链球菌及用其制备透明质酸的生产工艺技术方案为，一种兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）AWA008，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，保藏日期是2014年04月29日。

目前该兽疫链球菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCCNo.9111，菌种的拉丁文名称是Streptococcus zooepidemicus，参据的微生物（株）：AWA008，保藏日期是2014年04月29日。

本发明所述的兽疫链球菌菌株特征：呈球形或卵圆形，呈链状排列，有荚膜，无芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。

所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，包括以下步骤：

（1）摇瓶种子液培养：将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，培养，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；

（2）菌种扩配：将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，按无菌要求在种子罐里加入菌种培养，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；

（3）发酵；

（4）提纯。

所述的兽疫链球菌制备透明质酸的生产工艺，具体为：

（1）摇瓶种子液培养：将斜面菌种接种于装有灭菌培养液的1L锥形瓶中，37℃培养12-16小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于种子罐中；

（2）菌种扩配：将培养液加入到种子罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度36.3℃、pH6.86，按无菌要求在种子罐里加入菌种，维持罐压0.05MPa，培养12-16小时，镜检观察菌体生长良好，无杂菌污染，即可接种于发酵罐中；

（3）发酵：将一半发酵培养液加入到发酵罐中，进行蒸汽灭菌后，设定温度36.3℃、pH6.86，维持罐压0.05MP，将种子罐的培养基全部压入到发酵罐中，记录pH值，在pH下降时加入另一半发酵培养液，保持各项指标，发酵液pH每分钟下降幅度小于0.01时结束发酵，检测发酵液粘度，将发酵液压入沉淀罐中；

（4）提纯，包括以下工艺：

①前沉淀：向沉淀罐里在搅拌情况下缓缓地加入95%的酒精，至产生雪花状沉淀，控制在 47-50度（折至20℃时的酒精度），收集沉淀物；

②溶解：用氯化钠溶液将沉淀物溶解，调节pH至9.3-9.5，加入EDTA、活性炭、珍珠岩，搅拌均匀；

③过滤：将溶解后的料液压入1#大板框过滤一遍后，过滤液调pH9.3-9.5。再加入白硅藻土和珍珠岩后，搅拌均匀后，压入2#大板框过滤第二遍。二遍过滤液中加入硅藻土，搅拌均匀后，料液通过不锈钢板打循环澄清后，过滤第三遍，澄清度在99.5%以上，然后过滤液通过聚丙烯滤芯过滤至洁净间沉淀罐；