[发明专利]一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种凝结芽孢杆菌检测试剂盒，具体涉及尤其涉及用于凝结芽孢杆菌LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法，属于微生物检测技术领域。

 

背景技术

凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)呈杆状，两端钝圆，革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阳性，芽胞端生，无鞭毛。最适生长温度为45～50℃，最适pH 值为6.6～7.0。其能分解糖类生成L- 乳酸，为同型乳酸发酵菌。凝结芽孢杆菌是造成罐头食品平盖酸败和乳制品变质主要微生物。传统的平板计数已经渐渐不适应食品生产车间的快速节奏，荧光定量PCR被运用于食品厂中，检测凝结芽孢杆菌的存在。然而PCR法需要昂贵的PCR仪，并且操作繁杂，在实际运用中很受限制。

环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年Notomi等人开发出来的一项新技术，利用4条引物，并选择性地使用环引物，在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下，可使靶基因在60 min内得到大量扩增。反应中，模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，从而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结合，并进行链置换扩增反应。窦明理等基于SPO0A基因设计出了凝结芽孢杆菌的LAMP引物组，该引物组专一性不强，能同时检查多种耐热芽孢杆菌，而且SPO0A基因存在于很多微生物当中，不能针对性检测凝结芽孢杆菌。

经过对现有技术的文献检索未发现特异检测凝结芽孢杆菌的LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法相关研究报道，因此研制凝结芽孢杆菌LAMP检测的引物组、检测试剂盒及其检测方法十分必要。

 

发明内容

本发明提供一种凝结芽孢杆菌检测引物组、试剂盒及其方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。

本发明的第一个目的是提供一种凝结芽孢杆菌LAMP检测用引物组。本发明的第二个目的是提供凝结芽孢杆菌LAMP检测试剂盒。本发明的第三个目的是提供凝结芽孢杆菌LAMP检测方法。

本发明的检测方法经过一次简单的恒温扩增，就可以达到快速检测凝结芽孢杆菌的目的。采用该试剂盒和检测方法具有操作简单、灵敏度高的特点。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种凝结芽孢杆菌检测的引物组，其特征在于，所述引物组以凝结芽孢杆菌CK基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1-4相同。

其中，所述两对引物分别为：

外引物F3：TTTTGGCTCACGGAAGAG（SEQ ID NO.1），

外引物B3：TGAACTGGCAGTCATACG（SEQ ID NO.2），

内引物FIP：AGAACGCCTTCAAAATCGCACTT

TTAGCTTGAATTATTACGGGAC（SEQ ID NO.3），

内引物BIP：AACTTTAATAAGGCACCGATTGT

GGTTTTATCTCGGGGATTTTGTCG（SEQ ID NO.4）。

 

作为本发明的第二方面，一种采用所述的引物组的凝结芽孢杆菌检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含：引物组、阳性对照品、LAMP反应液、Bst DNA聚合酶和显色液。

其中，所述引物组，包括内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，其核苷酸序列与SEQ ID NO.1-4相同，所述外引物和内引物添加的摩尔比为 1 :4～8。

其中，所述阳性对照品为含有凝结芽孢杆菌的基因组 DNA。

其中，所述LAMP 反应液中含有 0.6～ 1.4mmol/L dNTP， 5～10 mmol/L  Mg²⁺，0.5～1.2mol/L Betaine，10×Thermopol Buffer。

其中，所述Bst DNA聚合酶和显色液为市售，显色液为GeneFinder。

 

作为本发明的第三方面，一种凝结芽孢杆菌检测试剂盒的凝结芽孢杆菌检测方法，其特征在于：包括以下的步骤：

（1）提供待测样品 DNA ；

（2）在 LAMP反应体系中加入所述引物组、LAMP反应液、BstDNA聚合酶，进行恒温扩增反应后灭活；