[发明专利]一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物，具体是一种荧光定量PCR检测方法及该方法中所用的特异性引物，属于细菌检测技术领域。

背景技术

大肠菌群(Coliform bacteria)是一群在37℃24小时能发酵乳糖产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，主要包括肠杆菌科的四个属即大肠埃希氏菌属(Escherichia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、产气克雷伯氏菌属(Klebsiella)和阴沟肠杆菌属(Enterobacter)。大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌。大肠菌群广泛存在于人和温血动物的肠道，并随粪便分布于自然界。大肠菌群既是粪便污染的指示菌，又是肠道致病菌污染食品的指示菌，是世界上大多数国家和组织评价食品卫生质量的重要安全性指标之一，在食品微生物指标体系中占有举足轻重的地位。

我国的食品卫生微生物标准体系主要由菌落总数、大肠菌群和致病菌三大类构成。大肠菌群的传统检测和计数方法有多管发酵法(MTF)和滤膜法(MF)。MTF是食品大肠菌群检测公认的传统方法，其原理是依据大肠菌群能够发酵乳糖，产酸产气的特点，将样品进行系列倍比稀释，接种到含有乳糖的培养基中，进行初发酵试验，观察产气情况，产气者进行复发酵试验。MTF优点是不需昂贵的仪器设备，经过基本微生物学培训的技术员即可操作；缺点是耗时费力，样品需要作系列稀释，加上复发酵试验大约需要96h。MF已在许多国家作为水质微生物检测的标准方法，核心是使用0.45μm的过滤膜过滤水样，将细菌截流在膜上，然后把膜放在选择性培养基中培养，计数膜上生长出的典型细菌集落。MF主要用于测定水中大肠菌群，虽然较MTF快，总需约48～72h，但仅适用于杂质较少的水体。

乳制品富含蛋白质、脂肪等营养物质，在生产、运输、加工和贮藏过程中，如果操作不当，极易受到大肠菌群的污染。统计显示，在影响中国食品安全的诸因素中，微生物污染高居首位。世界各国普遍将大肠菌群作为食品的细菌学常规检验指标之一，并且都对此卫生标准有明确规定，其检测结果的准确性直接关系到产品的品质和食品企业的经济效益，更关系到所有消费者的健康。乳制品企业大肠菌群的通用检测方法是国标方法，经过系列稀释、初发酵试验、复发酵验证等步骤，得出检验结果至少需要3-5天时间，对于货架期较短的食品非常不便。因此，提高大肠菌群检测的精确度和缩短检测时间是控制和保障食品安全的重要手段。

自1985年聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术问世以来，这一技术逐渐推广应用于生命科学的各个领域。因其具备快速、特异、灵敏、操作简便的特性，目前已被广泛应用于各种致病微生物的检测领域。但是常规PCR只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事，无法对扩增反应实时检测，因此常规PCR难以用于微生物的定量分析。实时荧光定量PCR技术是一种新型的核酸扩增技术，是DNA定量技术的一次飞跃，其主要是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术具有检测精度、灵敏度高，检测重复性好和线性范围广，操作简单、安全、自动化程度高，检测速度快、效率高等明显的优越性，是目前世界上公认的用于医学临床及生物学研究的最先进的核酸分子检测手段，已被世界各国研究机构承认并推崇。

然而，对于乳制品而言，通常成分复杂，其中可能含有多种抑制PCR反应的成分，且乳制品中大肠菌群限量指标较低，如何设计具有较高特异性和灵敏性的引物成为分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的一个关键。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的方法，以缩短乳制品中大肠菌群的检测时间，提高检测准确性，且可以定量地检测乳制品中大肠菌群。

本发明的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的特异性引物。

本发明的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的试剂盒，其中包含本发明所述的引物。

为达上述目的，一方面，本发明提供了一种利用分子生物学技术检测乳制品中大肠菌群的方法，该方法主要包括：

从待测乳制品样品中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2；