[发明专利]一种检测乳制品中大肠菌群的方法及所用引物

权利要求书

1.一种检测乳制品中大肠菌群的方法，该方法主要包括：

从待测乳制品样品中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为SEQ ID No.1与SEQ ID No.2；

对上述扩增结果进行分析判断。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测乳制品样品提取总DNA的过程包括如下步骤：

将待测乳制品样品进行増菌培养；

増菌培养后的样品离心，收集沉淀，加入TE缓冲液重悬，液氮冻融；加入SDS和蛋白酶K，37℃摇床4h以上；

加入CTAB提取缓冲液消化；

用酚仿法抽提；

加入异丙醇沉淀富集DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测乳制品样品提取总DNA的过程包括如下步骤：

按照30～50mL待测乳制品液态样品：250～350mL营养肉汤的比例，或者30～50g待测乳制品固态样品：250～350mL营养肉汤的比例进行混合，于37±1℃生化培养箱中増菌培养4～6h；

取増菌培养5h的样品1mL，12000g，4℃离心10min，收集菌体沉淀；

加入500μL TE缓冲液，重悬菌体沉淀，液氮冻融4次；

加入80μL10％SDS和10μL20mg/mL蛋白酶K，37℃摇床4h以上；

加入100μL5M NaCl溶液及80μL10mol/L CTAB溶液，65℃水浴20min；

用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，12000g，4℃离心10min，取上清；

用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提，取上清；

采用异丙醇沉淀DNA，70％乙醇洗涤，自然干燥，TE溶解备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR为荧光定量PCR，扩增反应条件如下：

反应体系：10μmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板2μL，Passive Reference Dye：0.4μL，2×TransStart Green qPCR SuperMix：10μL，ddH2O补足至20μL；

扩增程序：95℃预变性20s；40个循环，95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸40s。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述乳制品为液态乳制品、奶粉、冷饮。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其中，所述乳制品为含乳蛋白的冷冻饮品，其中，增菌培养时按照30mL含乳蛋白的冷冻饮品料液：300mL营养肉汤的比例进行混合，于37℃生化培养箱中増菌培养5h；之后提取DNA进行荧光定量PCR扩增检测；当低于荧光定量PCR检测限时，则含乳蛋白的冷冻饮品中大肠菌群数＜450MPN/100mL，符合相关卫生标准。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR为荧光定量PCR，该方法还包括制作荧光定量PCR标准曲线、并将扩增结果与标准曲线进行比对计算出待测样品中大肠菌群细菌的活菌数的过程。

8.用于实现权利要求1～7任一项所述检测乳制品中大肠菌群的方法的引物，该引物如SEQ ID No.1与SEQ ID No.2所示。

9.一种检测乳制品中大肠菌群的试剂盒，该试剂盒包含权利要求8所述的引物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，该试剂盒还包括Passive Reference Dye以及TransStart Green qPCR SuperMix。