[发明专利]一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法

说明书

技术领域

本发明涉及水稻利用领域，具体而言，涉及一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法。

背景技术

由于线粒体基因组的重组，导致植物线粒体基因组的序列具有很大的差异，比较分析任何两个植物物种(甚至是同源物种)的线粒体基因组的基因间区发现，大部分基因间区都不是保守的。因此，植物线粒体基因组存在各自特异的序列(Mitochondrial-specific sequences，简称MS)。

例如，将小麦Ks3和Km3的线粒体基因组进行比较，只有85.2％的序列为保守序列，Ks3包含11.38％的Km3所没有的特异序列，与NCBI数据库比较，7.3％Ks3序列为新序列，其中大部分特异序列位于进化速率快的基因间区。再如，比较Sugar beet TK81-MS和TK81-O线粒体基因组，发现，TK81-MS存在68kb TK81-O没有的MS，类核、类叶绿体、类线粒体-episome的MSS分别占7.6％、17.9％、0.1％和4.6％，其余为未知来源。

目前，水稻已测序完成了4个线粒体基因组，分别是水稻品种Nipponbare、9311、CW和LD。其中，Nipponbare是一个典型的粳稻品种，9311为典型的籼稻品种；CW细胞质来源于中国普通野生稻W1(Oryza rufipogon)；LD细胞质来源于籼稻品种缅甸的Lead水稻。水稻线粒体基因组最大的为CW(559,045bp)，而LD只有434,745bp，同线性分析表明，Nipponbare和9311较为保守，而CW和LD与其他两个已测序的水稻线粒体基因组在序列组成及排列上差异都很大，即水稻线粒体基因组也存在大量的特异序列(MS)。

由于不同的水稻种的线粒体基因组存在较大的差异，因此，对于其亲缘关系以及进化分析可采用相应的细胞质分子鉴定的方法。

在相关技术中，对水稻而言，一般采用RFLP分子标记研究其进化分析、亲缘关系；然而RFLP分子标记需要进行酶切、凝胶电泳、转膜以及放射性标记的探针杂交等一系列的操作，整个操作繁琐复杂、费时耗力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供了一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：

分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；

根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物；

提取不同品种的水稻的总DNA；

以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；

对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；

对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。

本发明的实施例中提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其通过分析比对4个已知水稻的线粒体基因组序列，筛选出了不保守的MS序列(多个)，然后再根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物，每个MS序列对应设置一对分子标记PCR引物。然后再以不同品种的水稻的总DNA为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；将扩增产物进行电泳检测，并筛选出能够导致扩增差异的多态性引物(对于每一种引物，如果一部分水稻种类能扩增出带，而另外一部分水稻种类不能扩增出带，则该引物为多态性引物)以及该多态性引物扩增得到的目的条带；再对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析，进而获得不同种类水稻的进化关系。

与现有技术中常见的RFLP分子标记相比，本发明提供的这种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其操作简便，所需设备也简单，只需要PCR仪、台式离心机以及凝胶电泳设备以及相应的分析软件即可完成整个鉴定操作，常规的分子实验室可完成整个实验操作，因此，克服了现有技术中RFLP分子标记操作繁琐复杂、费时耗力的缺陷。

另外，由于在水稻线粒体的MS位置区序列，其不易再发生线粒体基因组重组，因此，在本发明的实施例中，在利用所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物以及后续一系列操作开发的本的分子标记，其结果可靠稳定。