[发明专利]一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，具体公开了一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。

背景技术

罗非鱼隶属于鲈形目（Percifomes）、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)，是一种世界性的养殖鱼类。但近年来，由于养殖密度高、养殖环境恶化等原因，养殖罗非鱼暴发了链球菌病，导致养殖罗非鱼的大量死亡，造成巨大的经济损失并威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。因此，需要建立一种能有效抵御链球菌病的罗非鱼新品系。

转基因是一种快速高效的改良水产养殖品种性状的方法，关于转基因的方法有很多，而转座子转基因技术因为其操作方便且整合效率高而得到广泛应用。 Tgf2转座子是迄今为止在鱼类中发现的第二例有活性的转座子，能高效地介导目的基因与受体基因组的整合与遗传。目前关于Tgf2转座子报道多集中在产生带红色荧光蛋白标记的团头鲂和斑马鱼，但未见利用Tgf2转座子制备抗病转基因罗非鱼的相关报道。现有技术中关于转基因罗非鱼的报道一直都很少见，原因在于，罗非鱼特殊的繁殖特点导致了体外获得罗非鱼刚受精的卵是非常困难的。

发明内容

本发明为了克服现有技术中难于体外获得刚受精的罗非鱼卵的困难，导致转基因罗非鱼制备受限制的技术缺陷，提供一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案步骤如下：

S1.构建携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒；

S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为：将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察、掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；

S3.将S1所述的Tgf2 转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F₀代罗非鱼；

S4.当F₀代罗非鱼长至二月龄时，剪取鳍条提DNA，PCR检测，筛选出阳性个体，待阳性个体饲养至成鱼后与野生罗非鱼交配续代，即得到转基因F1代罗非鱼，再对转基因F1代罗非鱼进行阳性率检测，筛选得到能稳定遗传Hsp70与溶菌酶C3基因的转基因罗非鱼。

罗非鱼在繁殖过程中，雌性罗非鱼将受精卵含在嘴里孵化，孵出小鱼后再吐出来。即雌鱼排卵的同时，雄鱼排精，卵子完成受精后被随即被雌鱼含在口腔中。正是由于罗非鱼这一特殊的生殖方式，导致了难于获得刚受精的罗非鱼卵即处于单细胞期的受精卵以供显微注射。另外罗非鱼的产卵时间和周期会受到营养及外界环境（如温度、光照等）的影响，人工很难准确把握罗非鱼的产卵时间。

本发明首先研究出一种准确获取刚受精的罗非鱼卵的方法，在获取刚受精的罗非鱼卵的基础上，再利用Tgf2 转座子将Hsp70启动子和溶菌酶C3基因一起整合到罗非鱼的基因组上，得到能够诱导表达罗非鱼溶菌酶C3的罗非鱼新品系。从而提高罗非鱼的抗病菌能力。

所述携带罗非鱼Hsp70启动子和溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒包含有Tgf2 转座子的2个转座臂、Hsp70启动子、C型溶菌酶基因3和SV40的多聚腺苷酸识别序列，辅助质粒包含Tgf2 转座子的转座酶基因。

本发明在制备得到转基因F₀代罗非鱼后，将其培育达性成熟后，通过与野生型罗非鱼交配，获得能够稳定遗传Hsp70与溶菌酶C3基因的转基因罗非鱼F₁代，进而性成熟的F1代个体间配对即可获得F₂代转C3基因的罗非鱼。现有技术中在制备转基因鱼时，转植基因的整合率与可遗传率都偏低，因此通常难于获得可遗传品系。本发明借助转座子技术所制备的转溶菌酶C3罗非鱼，经过连续2代的传代筛选，已获得了能够稳定遗传的品系。

不同类型的溶菌酶的抗菌能力不同，不同鱼类来源的溶菌酶的抗菌能力也不同，优选地，本发明所述溶菌酶C3基因为奥利亚罗非鱼的溶菌酶C3基因，经前期实验验证其对无乳链球菌（GBS）等的溶菌能力较强。

优选地，本发明所述罗非鱼受精卵为尼罗罗非鱼的受精卵。