[发明专利]一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法

权利要求书

1.一种转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.以pTgf2-Hsp70-eGFP为出发质粒构建携带罗非鱼Hsp70启动子和奥里亚罗非鱼溶菌酶C3基因的Tgf2 转座子质粒；

S2.获取产卵后1小时以内、处于单细胞时期的罗非鱼受精卵，具体方法为将雌性罗非鱼进行室内饲养，控制温度25~30℃，每天14小时的光照，10小时的黑暗，每周投喂二次维生素E；观察雌鱼的繁殖活动，定期检测雌性罗非鱼口中是否含有卵，记下雌性罗非鱼每一次产卵的时间，掌握雌性罗非鱼的产卵周期；对处于产卵期的雌性罗非鱼进行人工挤卵，与挤出的雄性罗非鱼的精液混合获得处于单细胞时期的刚受精的罗非鱼卵；

S3.将S1所述的Tgf2 转座子质粒和能够提供转座酶的mRNA一起导入罗非鱼的受精卵中，得转基因F₀代罗非鱼；

S4.当F₀代罗非鱼长至二月龄时，剪取鳍条提DNA，PCR检测，筛选出阳性个体，PCR所用上游引物设计在Hsp70上，下游引物设计在罗非鱼的溶菌酶C3上，能扩增出目的带的个体，即为阳性个体，上游引物和下游引物的序列如SEQ ID NO：3~4所示；待阳性个体饲养至成鱼后与野生罗非鱼交配续代，即得到转基因F1代罗非鱼，再对转基因F1代罗非鱼进行阳性率检测，筛选得到能稳定遗传Hsp70与溶菌酶C 3基因的转基因罗非鱼。

2.根据权利要求1所述的转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，所述罗非鱼受精卵为尼罗罗非鱼的受精卵。

3.根据权利要求1所述的转溶菌酶基因罗非鱼的制备方法，其特征在于，显微注射时，每粒受精卵的注射质粒的体积为2nl，其中，Tgf2 转座子质粒的浓度为50ng/μl，辅助质粒的浓度为100 ng/μl。