[发明专利]利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种水质监测技术领域的方法，具体是一种利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法。

背景技术

铜离子在环境监测及生物学领域是一种重要的金属离子。人体曝露于高浓度的铜离子会引发各种不利的健康效应，如胃病、肠病、肝脏或者肾脏损伤、老年痴呆症、个体Menkes、Wilson疾病以及朊病毒病等。鉴于此，美国环保署(EPA)将饮用水中铜离子的最高允许值定为1.25ppm(约20μM)。因此，建立高灵敏度、高选择性的铜离子检测方法具有重要的现实意义。

传统的铜离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法，这些方法虽早已成熟并准确可靠，但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。新型的铜离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术，其中功能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。最常见的用于铜检测的功能核酸是铜离子特异性核酸酶(DNAzyme)，此类核酸酶检测铜的原理是其底物链中包含一个铜离子特异性酶切位点，铜离子可以特异性地从该位置将该底物链切断，通过将底物链的断裂过程转化成比色、化学发光和荧光等信号而达到检测目的。但核酸酶的一个缺点是其合成成本高，并且不稳定，容易失去活性。而单链寡核苷酸类的功能核酸具有合成成本低、稳定性好，易于转化为信号表达等优点，因此开发单链寡核苷酸类的铜离子特异性DNA来检测铜离子具有重大的研究价值和应用前景。

荧光法是一种简便、快速、灵敏的检测方法，已结合功能核酸(尤其是单链寡核苷酸类的功能核酸)被用来检测多种物质，关于铜离子的检测也有报道，但这些方法或需要用荧光基团标记功能核酸，或用到核酸酶，涉及复杂的催化反应。而利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法较少见报道。

经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN103160504A，公开(公告)日2013.06.19，公开了一种食品安全技术领域的用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法，通过对比探针中加入其它五种金属离子Zn²⁺、Cd²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺在260nm处的荧光强度，得到所述探针对于铅离子的特异性结果，并通过荧光强度变化实现Pb22的定性检测；通过对探针中加入已知浓度的Pb²⁺，并且在260nm处扫描荧光强度，从而构建出Pb²⁺浓度与荧光强度之间检测体系及其线性关系曲线；随后将待测样品在260nm处扫描出的荧光强度值代入线性关系曲线，从而得到Pb²⁺的浓度并实现定量检测。但该技术所用的核酸需要标记三个荧光基团，合成成本高；其核酸酶底物链中包含的腺嘌呤核糖核苷酸(rA)容易降解；特异性验证只涉及其他五种金属离子，存在一定的局限等。

发明内容

本发明针对现有技术存在的诸如：需要对核酸进行荧光标记、DNAzyme的合成成本高并且不稳定、涉及复杂的催化反应等缺陷，提出一种利用铜离子特异性DNA和SYBR Green I荧光法检测铜的方法，通过比较荧光信号的变化，即可实现对铜离子的检测。本方法提供的检测方法灵敏度高选择性好，最低检测限为5.57ppb，操作简便快捷且不依赖大型仪器设备，可用于水体铜的实时原位检测。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过含有铜离子特异性DNA的检测液制备得到标准铜离子检测体系，通过与空白对照液共同检测荧光强度后制成浓度‐相对荧光强度标准曲线；最终在检测时通过将待测水样置于含有铜离子特异性DNA的检测液中，经检测荧光强度并对照标准曲线实现铜离子浓度的检测。

所述的铜离子特异性DNA，即Cu100序列，如Seq ID No.1所示，具体为：

(5'‐AGATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGC TGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC‐3')。

所述的标准铜离子检测体系是指：在若干支所述检测液中加入已知且不同浓度铜标准液后，进一步加入DNA嵌入剂SYBR Green I。

所述的空白对照液是指：在所述检测液中仅加入DNA嵌入剂SYBR Green I。