[发明专利]RNA核滞留载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于生命科学核酸研究领域，具体涉及一种可以将外源表达的RNA滞留在细胞核中的RNA表达载体及其制备与应用。

背景技术

长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)长度大于200个核苷酸，但是缺乏蛋白编码能力。在哺乳动物基因组的上千个位点可以产生lncRNA。已有很多研究表明lncRNAs参与了一系列的基因表达调控和生物学过程(参见综述Ulitsky and Bartel,2013；Batista and Chang,2013)。截至目前，人们认为lncRNAs可以招募、组装、修饰相互作用因子发挥作用等，如NEAT1(Mao et al.,2011)、HOTAIR(Rinn et al.,2007；Tsai et al.,2010)、ANRIL(Yap et al.,2010)、sno-lncRNAs(Yin et al.,2012)等。有意思的是，许多lncRNAs所介导的调控是发生在细胞核内的，因此需要新的工具来研究lncRNAs在细胞核内的功能。

如同研究编码基因一样，lncRNA也需要通过质粒载体将其在细胞里进行过表达来研究。然而，目前已知的真核表达载体的设计目的是用来表达编码基因的，载体上含有转录元件、翻译元件和一些促进核质运输(细胞核和细胞浆运输)的元件。因此，这些载体上的转录本就会按照mRNA的加工方式进行加工，并且运到细胞浆里。即使一些仅定位在细胞核中的内源lncRNAs，但是当用这些载体外源表达时，它们经常会被运到胞浆里，从而阻碍了lncRNA的正常作用，导致出现错误的结论。

因此，针对上述现有技术中所存在的问题，基于实验室近期发现的一类新型的来源于内含子的lncRNA sno-lncRNA，我们设计并构建了一种可以把所外源表达的任意RNA滞留在细胞核内的表达载体，即“snoVector”，并证明了所述RNA载体可以稳定地表达所研究的RNA序列，并成功地将其滞留在细胞核中，还进一步证明了所述RNA载体所表达的滞留在细胞核的RNA可以发挥正常功能。

本发明为研究细胞核RNA的功能提供了工具支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以将外源表达的RNA滞留在细胞核中的RNA表达载体及其构建与应用，为研究lncRNA的功能提供工具支持。

本发明的第一方面，公开了一种RNA表达载体，所述载体用于将外源表达的RNA滞留在细胞核中。所述RNA表达载体是由pZW1质粒改造获得，所述RNA表达载体为在pZW1的EGFP(增强型绿色荧光蛋白)序列的多克隆位点区域插入5’至3’方向依次排列的SNORD116-13片段、SNORD116-14片段所获得。其中，所述多克隆位点区域是指两个半个EGFP外显子中间的内含子区域。

较优的，所述pZW1的EGFP序列如SEQNO.1所示。其中，所述pZW1的EGFP序列的起始密码子序列为ATG，终止密码子序列为TAA，内含子区域的序列为GTAAGTCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGTCTCTTTCTTCCAG。

较优的，所述SNORD116-13片段的序列如SEQ ID NO.2所示，所述SNORD116-14片段的序列如SEQ ID NO.3所示。

更优的，所述SNORD116-13片段的插入位点为XhoI酶切位点和EcoRI酶切位点之间，所述SNORD116-14片段的插入位点为EcoR I酶切位点和SacII酶切位点之间。

最优的，所述RNA表达载体的EGFP序列的内含子区域的结构为：

XhoI-BglII—SNORD116-13—EcoRI-PstI-SalI–KpnI—SNORD116-14—PacI-SacII。

引入酶切位点是为了便于插入外源序列。

本发明第二方面公开了前述RNA表达载体的构建方法：通过PCR的方法在所述SNORD116-13片段和SNORD116-14片段的两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将所述SNORD116-13片段和SNORD116-14片段插入pZW1质粒载体，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本发明的RNA表达载体。

较优的，所述RNA表达载体适用于Hela细胞系和PA1细胞系等哺乳动物细胞系。