[发明专利]一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法

权利要求书

1.一种与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，

将含有虫草菌丝的发酵产物低温出罐后分装到装有一定分离培养基的分装器皿中进行暗培养，培养至有虫草菌丝体长出并与所述分离培养基分离，其中所述分离培养基包含下列重量份的组分：葡萄糖8-12，豆粕1-3及无菌水800-1200；

此外，还包括以下步骤：

步骤一、虫草菌种的筛选，将虫草菌丝接种于蚕蛹，通过自然培育法进行培育，在经过一定条件的温差和光照刺激后，选取优良虫草菌株作为虫草菌种，并将虫草菌种继续培养至孢子成熟；

步骤二、虫草菌种的驯化，将孢子成熟的虫草菌种的子囊部位组织悬于装有一定浓度生理盐水的组织培养瓶顶部，进行一定条件的光照培养后将生理盐水转接液体培养基进行液体培养，得到性状稳定的虫草菌株；

步骤三、发酵培养，将所得到的性状稳定的虫草菌株逐级扩大培养后，接种发酵罐进行一定时间的变温好氧发酵，得到含有虫草菌丝的发酵产物。

2.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤三中发酵所用培养基包含下列重量份的组分：土豆粉8-12，蛋白胨2-4，葡萄糖20-30及无菌水800-1200；

所述变温好氧发酵的发酵条件为：充氧量8.5-9.0ppm，15-17度培养2-3天后，继续于18-19度培养1-2天，然后于19-21度培养3-5天。

3.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤四中所述发酵产物与分离培养基的重量比为1∶13-18，所述分装器皿的装量为总容积的16-18％，分装完成后于20-24度进行暗培养35-40天。

4.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤一中所述虫草菌丝通过以下方法得到：

切取虫草菌株子囊部位组织，将其进行外部消毒处理后，加入到装有少量无菌0.5-1％葡萄糖培养液的组织培养瓶中，于22-24度进行组织分离培养3-7天后，经过分离得到虫草菌丝。

5.如权利要求4所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤一中所述自然培育法包括以下步骤：

步骤一，将虫草菌丝接种于蚕蛹，将接种虫草菌丝的蚕蛹进行变温培养，所述变温培养的培养温度顺次为：12-14度培养2-3天，14-16度培养1-2天，18-19度培养1-2天，19-21度培养至蚕蛹僵化且有菌丝长出蚕蛹；

步骤二、将长出菌丝的蚕蛹进行总温差为7-8度的梯度温度变化刺激培养2-7天，设定湿度为60-70度，温度变化率为1-2度／小时。

6.如权利要求5所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述自然培育法的步骤二中，在进行温度刺激培养至菌丝呈一定的团球状时对培养物进行不低于200勒克斯的光照刺激。

7.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤二中所述光照培养方法为26-30度光照培养30-40小时；所述液体培养方法为将所述生理盐水接种于含有全麦汁的试管中，于17-19度培养2-5天。

8.如权利要求7所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，可将得到的性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存，所述固体斜面采用全营养培养基制成，保存温度为3-4度。

9.如权利要求8所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，所述性状稳定的菌株接种固体斜面进行保存后，在使用前需对菌株进行菌株活化，所述菌株活化的方法为：

将接种有性状稳定的菌株的固体斜面于16-18度放置1-2小时后，将菌株转接至麦汁营养液中，于16-18度培养2-4天。

10.如权利要求1所述的与培养基分离的固体活性虫草菌丝体的制备方法，其特征在于，步骤三中所述逐级扩大培养方法为：

将性状稳定的菌株逐级转接营养液进行液体摇床培养，每级转接扩培比例不大于40倍，所述营养液包括下列重量份的组分：土豆粉15-25，微量元素组合物，葡萄糖15-25及无菌水800-1200；其中所述微量元素组合物包括磷酸二氢钾1-3、硫酸亚铁0.5-2、硫酸镁0.3-1和碳酸钙1-3中的一种或几种。