[发明专利]一种利用miR-145为标志物的肝癌患者血清检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及一种利用循环miR-145作为肝癌血清标志物及其检测试剂盒。 

背景技术

肝癌是一种常见的恶性肿瘤，据报道，世界范围内每年新增肝细胞癌患者达到700,000以上。中国是全球肝癌发病率最高的国家，有统计显示，我国肝癌发病人数占全球55％，死亡人数占全球45％，列癌症死亡的第二位，而且发病率不断上升。肝细胞癌的早期发现、早期诊断、早期治疗对肝癌患者的预后和存活时间至关重要。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)是迄今人类发现的第一个具有诊断价值的肿瘤标志物，在原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)发生发展中扮演着重要的角色。但根据临床资料，约有30％～40％肝癌患者血清AFP阴性，而中国又是原发性肝细胞癌的高发国家，近年来报道的血清AFP阴性原发性肝细胞癌有增多趋势。这部分肝癌患者缺乏有效的肿瘤标志物用于预后判断与疗效评价。因此，新的肝癌血清标志物，尤其是AFP阴性肝细胞癌的血清标志物的检测具有重要的临床意义。 

microRNA(miRNA)是一类长约22nt的非编码小RNA分子，它们通过与靶基因3′UTR结合降解靶基因或者抑制翻译，在多种生理过程中发挥重要作用。研究表明，microRNA与癌症的发生发展有十分密切的关系。许多肿瘤患者血清中循环microRNA水平发生明显特异性变化，可以用作肿瘤检测生物标志物。肝癌的发生发展过程由多种复杂的调控通路参与，其中miRNA也参与了肝癌致病相关基因的转录后调控。近期越来越多的研究发现，miRNA能够参与到肝癌发生发展各个过程之中。 

本发明证实，miR-145在AFP为阴性的肝癌患者血浆中含量明显低于正常，这种特性能作为这种疾病的标志分子，用于临床诊断。进一步研究证实在肝癌细胞中miRNA-145能抑制人肝癌细胞的增殖、迁移作用。 

发明内容

本发明的目的在于提供miR-145作为肝癌血清分子标志物。 

本发明的目的在于提供一种检测miR-145表达量的引物。 

本发明的目的还在于提供一种肝癌血清检测试剂盒。 

本发明的目的还在于提供一种非诊断目的的肝癌血清检测方法。 

一种检测miR-145表达量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示。 

一种肝癌血清检测试剂盒，所述试剂盒包含序列表中SEQ ID No.2，SEQ ID No.3所示的引物，标准样品，内参引物，反转录酶，dNTPs，buffer，RNA酶抑制剂和灭菌水。 

所述标准样品为未经过处理的人血清样品中的RNA反转录成的cDNA。 

一种非诊断目的的肝癌血清检测方法，按照如下步骤进行： 

(1)提取待检样品的总RNA； 

(2)将步骤(1)得到的总RNA反转录为cDNA； 

(3)利用权利要求3或4所述的一种肝癌血清检测试剂盒，以步骤(2)得到的cDNA为模板，做定量PCR，检测样品中miR-145的表达量； 

(4)若待检样品的表达量显著高于标准样品的表达量，则该待检样品取自肝癌患者的生物样品。 

本发明的有益效果：本发明的方法简单，迅速，灵敏，适用于检测患者是否患有肝癌。 

附图说明

图1是定量PCR检测正常人血清与AFP为阴性的肝癌患者血清中miR-145含量的结果。 

图2是定量PCR检测人肝癌细胞中miR-145含量的结果。 

图3转染NC、si-VASN、miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2中VASN mRNA水平的影响。 

图4转染NC、si-VASN、miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2中VASN蛋白水平的影响。 

图5是MTT实验检测转染miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响。 

图6是划痕实验检测转染miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2迁移的影响。 

图7是Transwell实验检测转染miR-145 mimics与miR-145 inhibitor后，对人肝癌细胞株HepG2迁移的影响。